張艷花，王力儉，徐新明，瑪爾孜亞，于麗娟，拉扎提，阿扎提，周喜榮，田可川

（新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院，烏魯木齊 830000）

近年來(lái)細(xì)毛羊育種者不斷探索通過(guò)分子育種手段尋找控制羊毛纖維直徑性狀的基因或標(biāo)記來(lái)提高育種效率［1］。CTNNB（β-catenin）基因作為影響毛囊發(fā)育的 Wnt蛋白信號(hào)［2］通路中心環(huán)節(jié)［3-4］，對(duì)毛囊發(fā)育、毛囊生長(zhǎng)起著重要作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)WNT/β-catenin對(duì)毛囊再生時(shí)真皮乳頭的誘導(dǎo)特性的維持是必要的，毛囊形態(tài)發(fā)生過(guò)程和毛囊再生形態(tài)和信號(hào)的表達(dá)具有很大的相似性，β-catenin在表皮層化后未出現(xiàn)基板形態(tài)之前首次均一散在出現(xiàn)于臨近表皮的真皮間充質(zhì)細(xì)胞。隨著表皮基板增厚，基板部位β-catenin信號(hào)的上調(diào)，散在表達(dá)的WNT/β-catenin 信號(hào)消失［7］?；逍纬珊?，基板下部開(kāi)始聚集的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞聚集一定數(shù)量后也開(kāi)始表達(dá)β-catenin。隨后毛囊開(kāi)始下陷，形成毛芽。伴隨著毛囊下陷，β-catenin表達(dá)消失一段時(shí)間；毛囊成形后毛球部位出現(xiàn)毛囊圓錐時(shí)再次在圓錐部位出現(xiàn)。隨后毛母質(zhì)、前皮質(zhì)區(qū)、根鞘都出現(xiàn)WNT/β-catenin信號(hào)的表達(dá)上調(diào)。這種上調(diào)表達(dá)一直持續(xù)到毛囊成熟毛纖維形成毛干［4］。但CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有關(guān)研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)以CTNNB1基因?yàn)楹蜻x基因，利用中國(guó)美利奴羊中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點(diǎn)，運(yùn)用最小二乘均值分析各多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)毛性狀之間的關(guān)系，找到與產(chǎn)毛性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，以進(jìn)一步提高細(xì)毛羊的生產(chǎn)性能，改善羊毛品質(zhì)，為細(xì)毛羊經(jīng)濟(jì)性狀的早期標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)和技術(shù)貯備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來(lái)源及采樣方法 實(shí)驗(yàn)采集新疆鞏乃斯種羊場(chǎng)有系譜記錄的中國(guó)美利奴羊874只，實(shí)驗(yàn)羊群體為周歲母羊。一次性針頭采集羊頸靜脈血液2mL，放入醫(yī)用肝素鈉抗凝試管，上下顛倒5次確?？鼓湃?20℃冰箱保存。同時(shí)采集每一只羊體側(cè)毛樣，用光學(xué)纖維直徑分析儀（OFDA100）測(cè)定分析該毛樣羊毛平均纖維直徑。

1.1.2 主要試劑 DP319血液基因組DNA提取系統(tǒng)、dNTPs、TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（MarkerⅠ、MarkerⅣ）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 采用天根生化科技（北京）有限公司DP319血液基因組DNA提取系統(tǒng)，提取基因組DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度并估計(jì)含量，利用核酸蛋白定量?jī)x測(cè)定其含量，稀釋到 100 ng/μL。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank公布的羊CTNNB1基因，得到mRNA部分序列（GQ372826.1），長(zhǎng)度約為407bp，在NCBI及UCSC上查找比對(duì)，尋找與該基因同源性較高的物種的基因，通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)綿羊CTNNB1基因mRNA序列與牛CTNNB1基因高度同源。以牛CTNNB1基因?yàn)閰⒖夹蛄?，以羊的mRNA部分序列為模板，分3段設(shè)計(jì)引物。利用在線引物設(shè)計(jì)程序（http：//fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm）初步設(shè)計(jì)了32對(duì)引物，通過(guò)oligo6軟件檢測(cè)，選取合適引物6對(duì)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定了3對(duì)引物，如表1所示。

表1 CTNNB1基因測(cè)序引物序列

1.2.3 PCR過(guò)程 利用設(shè)計(jì)的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)期的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為300 bp、1 200 bp、2 000 bp。反應(yīng)體系：l0×Buffer擴(kuò)增緩沖液2.0 μL，Mg2+（25 mM）1.2 μL，dNTP 混合物（2.5 mM）1.5 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5u/μL）0.2μL，模板 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.1μL。反應(yīng)條件：①200～600 bp 片段，95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；②1 000～2 500 bp 片段，95 ℃ 8 min；95℃ 45 s，55 ℃45 s，72℃2.5 min，38個(gè)循環(huán)。根據(jù)擴(kuò)增效果篩選3對(duì)引物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 SNP位點(diǎn)篩選及分型檢測(cè) 隨機(jī)從13個(gè)不同公羊的女兒中，選取羊毛纖維直徑差異較大的40個(gè)個(gè)體的基因組，從每個(gè)DNA樣本中選取5 μL共200 μL的DNA混合構(gòu)建成DNA池。選取擴(kuò)增效果較好的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物分裝，各30 μL分別送至擎科生物公司及華大公司測(cè)序，分析測(cè)序峰圖查找SNP位點(diǎn)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，使用美國(guó)西昆諾姆公司的Mass ARRAY對(duì)實(shí)驗(yàn)群體進(jìn)行SNP分型檢測(cè)，然后統(tǒng)計(jì)基因型。

1.3 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)不同基因型的個(gè)體數(shù)量，計(jì)算基因頻率和基因型頻率，利用Popgene Version（3.2）軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。

采用SAS8.2中的MIXED過(guò)程對(duì)中國(guó)美利奴羊CTNNB1基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性與羊毛纖維直徑、羊毛纖維直徑變異系數(shù)和羊毛產(chǎn)量性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，具體公式為：

其中，y為性狀表型觀察值；μ為性狀的群體均值；RAM為公羊家系；G為SNP效應(yīng)；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) 對(duì)混合池基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行正反向測(cè)序。用Chromas軟件打開(kāi)測(cè)序峰圖，用DNAMAN進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SNP突變位點(diǎn)，分別是819G＞A、974A＞G。

圖1 CTNNB1基因池的測(cè)序峰圖（圈圖處為突變位點(diǎn)，為反向測(cè)序結(jié)果）

2.2 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分析 CTNNB1基因的2個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)中819G＞A突變位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，974A＞G位點(diǎn)處于極不平衡狀態(tài)，突變位點(diǎn)G等位基因頻率（0.30）明顯低于野生型A等位基因頻率（0.70）。

表2 SNPs等位基因頻率和基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.3 基因多態(tài)性羊毛直徑性狀的關(guān)聯(lián)分析 多重比較分析表明，CTNNB1基因974A＞G位點(diǎn)的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型、819G＞A位點(diǎn)的GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型。等位基因替代效應(yīng)分析表明CTNNB1基因819G＞A位點(diǎn)對(duì)羊毛纖維直徑加性效應(yīng)達(dá)到極顯著水平，顯性效應(yīng)達(dá)到顯著水平，等位基因由A變?yōu)镚時(shí)羊毛纖維直徑會(huì)降低。

表3 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)對(duì)羊毛纖維直徑性狀的影響

表4 CTNNB1基因SNP位點(diǎn)在羊毛纖維直徑性狀上的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)

3 討論

1）CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因，在國(guó)內(nèi)屬首次研究。本研究發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因上與羊毛纖維直徑相關(guān)的2個(gè)SNP突變位點(diǎn)，表明CTNNB1基因與羊毛纖維直徑性狀有著較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。

2）本研究首次發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因上819G＞A位點(diǎn)GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型，974A＞G位點(diǎn)的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型。因此CTNNB1基因作為新的影響羊毛纖維直徑的候選基因值得進(jìn)一步探討，本研究為CTNNB1基因位點(diǎn)應(yīng)用于羊毛纖維直徑標(biāo)記輔助選擇提供了一定的參考。此外作為影響毛囊發(fā)育的Wnt蛋白信號(hào)通路中心環(huán)節(jié)基因CTNNB1，值得進(jìn)一步采取定量分析研究其影響羊毛纖維直徑的機(jī)理。

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