王 威，王子旭，田 維，史 紅，江海濤

近年來隨著飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，由高脂飲食和飲酒所致混合性脂肪肝及脂肪性肝炎呈上升趨勢。各種原因引起肝內(nèi)脂質(zhì)堆積過多，使得肝臟總脂量超過肝質(zhì)量的5%，即稱為脂肪肝[1]。預(yù)防和治療脂肪肝已經(jīng)成為中、西醫(yī)臨床和基礎(chǔ)研究的重要課題。張伯禮教授在多年臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上提出以疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝。疏肝導(dǎo)濁方藥由丹參、姜黃、荷葉、何首烏等中藥組成，具有清熱化濕、疏肝利膽的功效。臨床實(shí)踐及動物實(shí)驗(yàn)研究均證明，疏肝導(dǎo)濁方藥對脂肪肝治療有很好的療效[2-3]。本實(shí)驗(yàn)研究以HepG2細(xì)胞株為研究對象，采用中藥單體丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿和何首烏堿對HepG2肝細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀察疏肝導(dǎo)濁方藥中每味中藥單體對HepG2肝細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAII及 ApoCII表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究疏肝導(dǎo)濁方藥治療脂肪肝的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），小牛血清（Hyclone.com 公司）；胰酶（Gibio公司），胰蛋白酶（Sigma公司），DMSO（Sigma公司），HEPES（Sigma公司），噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司）。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱，（FORMA3111，THERMO公司）；倒置相差顯微鏡，（LEICA DMIL，LEICA公司）；超凈工作臺，（蘇州安泰公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡SP2（德國Leica公司）；電泳儀，EC120/CSSU78（美國 Bio Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)，GIS－2019（北京天能公司）；離心機(jī) 6R（Allegra 64，Beckman－Coulter公司）；蠕動泵（MILLI PORE 公司）；酶標(biāo)分析儀（THERMO Labsystens公司）。

1.3 細(xì)胞來源 HepG2肝細(xì)胞株由天津心血管研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞株為第74代。

2 方法

2.1 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2肝細(xì)胞株在含有DMEM+10%新生小牛血清培養(yǎng)中，消化液采用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，胰蛋白酶終濃度為0.25%，EDTA終濃度為0.05%，HepG2細(xì)胞接種于75 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱傳代培養(yǎng)。飽和濕度，貼壁生長，待細(xì)胞長滿80%瓶底，消化液消化傳代。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將HepG2細(xì)胞分為5組，正常組、丹酚酸B組、姜黃素組、荷葉堿組、何首烏堿組，每組設(shè)6個復(fù)孔。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

2.3.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 每孔加入1mLTrizol，提取總RNA，按照試劑盒說明cDNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為30℃10min，50℃30min，99℃5min，5℃5min為一個循環(huán)，完成逆轉(zhuǎn)錄。

2.3.2 PCR引物及反應(yīng)條件 見表1。

表1 引物序列（引物由賽百盛公司合成）

反應(yīng)條件：起始變性94℃5min，變性94℃30秒，退火55℃45秒，延伸72℃7 min。β－actin退火溫度為64℃，其余作用條件同上。各體系均進(jìn)行30個循環(huán)。

2.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物分析 取5 μL產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳25 min，利用凝膠成像分析系統(tǒng)、掃描、拍照，計(jì)算目的基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積與β-actin基因RT-PCR產(chǎn)物吸光度容積之比值作為mRNA相對含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果

丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿、何首烏堿對HepG2細(xì)胞株脂代謝基因 PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ和ApoCⅡmRNA的表達(dá)水平，見表2。

表2 中藥單體對HepG2細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響（s）10-6mol/L

表2 中藥單體對HepG2細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響（s）10-6mol/L

n PPARαHLApoB100ApoAⅡApoCⅡmRNAmRNAmRNAmRNAmRNA空白對照 6 1.02±0.06 1.01±0.03 1.02±0.07 1.04±0.06 1.04±0.04丹酚酸 B 6 1.34±0.06 1.12±0.04 0.60±0.01 0.99±0.06 1.21±0.06姜黃素 6 1.22±0.05 0.92±0.03 0.60±0.01 1.16±0.07 0.70±0.01荷葉堿 6 1.34±0.05 1.02±0.05 1.07±0.09 1.04±0.07 0.81±0.02何首烏堿 6 0.51±0.01 0.42±0.02 0.72±0.01 1.06±0.04 1.10±0.04組別

丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿能夠刺激HepG2細(xì)胞PPARα mRNA表達(dá)水平升高，而何首烏堿可使PPARα mRNA表達(dá)下調(diào)（見圖1-A）；丹酚酸B能夠刺激HepG2細(xì)胞HL mRNA水平升高，姜黃素和首烏堿使HL mRNA表達(dá)水平下調(diào)（見圖1-B）；荷葉堿不能刺激HepG2細(xì)胞株ApoB100 mRNA表達(dá)上調(diào)，丹酚酸B、姜黃素、首烏堿均使ApoB100 mRNA表達(dá)下調(diào)（見圖1-C）；姜黃素能夠刺激ApoAⅡmRNA表達(dá)上調(diào)；丹酚酸B、荷葉堿和首烏堿均不能調(diào)節(jié)ApoAⅡmRNA的表達(dá)（見圖1-D）；丹酚酸B和何首烏堿可升高ApoCⅡmRNA表達(dá)水平，荷葉堿、姜黃素能夠刺激HepG2細(xì)胞ApoCII mRNA表達(dá)水平下調(diào)（見圖1-E）。

圖1 中藥單體對細(xì)胞脂代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

4 討論

脂肪肝是由于脂質(zhì)代謝紊亂造成脂肪在肝臟內(nèi)沉積而出現(xiàn)的多種病理生理學(xué)病變，主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化，進(jìn)一步發(fā)展可能形成肝硬化[1]。臨床實(shí)踐證明，張伯禮教授的疏肝導(dǎo)濁中藥方治療脂肪肝有很好的療效。丹參總酚酸具有活血，降脂作用，可以使?jié)嵝耙子谙?，而且丹參味苦性降，有下行之意，對疏肝?dǎo)濁具有較好的療效；姜黃性溫，歸脾、肝經(jīng)。研究表明，姜黃素具有降低高脂血癥大鼠血清總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白（LDL-C）的作用，對家兔動脈粥樣硬化的形成亦有抑制作用。并能提高血清中的總抗氧化能力及過氧化物歧化酶（SOD）活性，從而降低血脂[4]；荷葉生物堿具有抑制高膽固醇癥和動脈粥樣硬化及抗有絲分裂等作用，對于降低血脂水平，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝具有較好的效果；何首烏既可養(yǎng)血益肝、固精益腎；又可潤腸通便，可以減輕脂肪肝患者的乏力等癥狀。為進(jìn)一步探討張伯禮院士的疏肝導(dǎo)濁法治療脂肪肝的作用機(jī)制，筆者采用疏肝導(dǎo)濁法復(fù)方中藥中各味藥單體丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿和何首烏堿，分別對HepG2肝細(xì)胞株進(jìn)行干預(yù)，觀察這些中藥單體對HepG2肝細(xì)胞株脂代謝相關(guān)基因PPARα、HL、ApoB100、ApoAⅡ及 ApoCⅡ表達(dá)的影響，進(jìn)一步研究疏肝導(dǎo)濁方藥治療脂肪肝的作用機(jī)制[1]。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一種同醇類激素受體，有3種亞型α，β，γ，其中的PPARα參與調(diào)節(jié)編碼肝脂肪酸結(jié)合蛋白、載脂蛋白AⅡ、載脂蛋白CⅢ等基因的轉(zhuǎn)錄、活化、調(diào)節(jié)脂肪酸的攝取、結(jié)合及脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等。在脂質(zhì)代謝中起著重要的作用[2]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明丹酚酸B、姜黃素、荷葉堿能夠刺激HepG2細(xì)胞PPARα mRNA表達(dá)水平升高，從而促進(jìn)高密度脂蛋白（HDL）的主要載脂蛋白apoAI，apoAⅡ轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而使血漿HDL升高；降低肝臟apoCⅢ的產(chǎn)生，增加脂蛋白酯酶的表達(dá)；伴隨β氧化增加，降低甘油三酯的水平。

肝脂酶（HL）是體內(nèi)一種重要的調(diào)節(jié)脂代謝的脂酶，不僅具有多種脂酶活性，而且可作為配體促進(jìn)LDL和乳糜微粒（CM）殘粒進(jìn)入肝細(xì)胞而被清除[3]，并能直接參與高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）的逆轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白殘粒的分解代謝[4]，HL的主要功能主要與降低血脂有關(guān)，主要作用于極低密度脂蛋白（VLDL）、β-VLDL及VLDL殘粒中的甘油三酯（TG）。HDL中積累的未酯化膽固醇在HL作用下由肝攝取，在HDL3轉(zhuǎn)化為HDL2的過程中可防止肝外組織過量膽固醇的積累，其中HL起重要作用。實(shí)驗(yàn)證明，丹酚酸B能夠刺激HepG2細(xì)胞HL mRNA水平升高，HL mRNA的表達(dá)增加有助于肝臟中的脂肪分解代謝，有利于肝臟中β氧化，從而降低肝臟中甘油三酯的含量。

載脂蛋白是構(gòu)成血漿脂蛋白的重要組分，賦予脂類以可溶的形式，而且在血漿脂蛋白代謝中起重要作用：1）促進(jìn)脂類運(yùn)輸。2）調(diào)節(jié)酶活性。3）引導(dǎo)血漿脂蛋白同細(xì)胞表面受體結(jié)合。是功能上極其活躍的一組血漿蛋白質(zhì)，見表3。ApoB100是LDL受體的配體，其負(fù)責(zé)LDL在體內(nèi)的清理、參與VLDL的合成與分泌、向組織運(yùn)輸脂類和膽固醇等，是一種重要的脂蛋白[8]。Espinosa等[9]通過轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究，認(rèn)為野生型小鼠與ApoB100超表達(dá)的小鼠相比，野生型小鼠對高脂肪食物的消化和吸收能力較差、血脂水平較低。本實(shí)驗(yàn)中丹酚酸B、姜黃素、何首烏堿、荷葉堿均能刺激HepG2細(xì)胞株ApoB100 mRNA表達(dá)上調(diào)，ApoB100合成增加，可使肝臟中的甘油三酯形成VLDL轉(zhuǎn)運(yùn)出肝臟，降低肝脂。另外，ApoAⅡ是HL的激活劑，能夠促進(jìn)HL的活性上升，使肝臟中脂質(zhì)代謝加強(qiáng)。姜黃素和何首烏堿能夠刺激ApoAⅡmRNA表達(dá)上調(diào)。丹酚酸B和何首烏堿可升高ApoCⅡmRNA表達(dá)水平，而ApoCⅡ是LPL的激活劑,能夠促進(jìn)LPL的活性增加使體內(nèi)脂質(zhì)代謝加強(qiáng)。

表3 載脂蛋白及其功能

值得注意的是，不同的中藥單體藥效作用有差別：1）丹酚酸 B 可促進(jìn) PPARα、HL、Apo CⅡ mRNA的表達(dá)，抑制ApoB100 mRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoAⅡmRNA的表達(dá)。2）姜黃素可促進(jìn)PPARα、ApoAⅡ mRNA 的表達(dá)，抑制 HL、ApoB100、ApoCⅡmRNA的表達(dá)。3）荷葉堿可促進(jìn)PPARα、HL mRNA的表達(dá)，抑制Apo CⅡmRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoB100、ApoAⅡmRNA的表達(dá)。4）何首烏堿能夠促進(jìn)ApoCⅡmRNA的表達(dá)，抑制HL、PPAR、ApoB100 mRNA的表達(dá)，不能調(diào)節(jié)ApoAII mRNA的表達(dá)。

以上實(shí)驗(yàn)可以看出中藥單體藥效作用部位和機(jī)制，明確了中藥單體的相對作用靶位，也同時可以比較出復(fù)方中藥作用是多靶點(diǎn)共同作用的結(jié)果，為研究疏肝導(dǎo)濁方藥的治療脂肪肝提供了理論基礎(chǔ)。

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