馬珂，李滇華，邢振楠，王洪剛，楚金玉

（1.伊春原生態(tài)食用菌研究所，黑龍江 伊春 153000；2.黑龍江北方林業(yè)有限公司）

小興安嶺伊春地區(qū)是我國黑木耳的主產(chǎn)區(qū)之一，每年栽培量在4億袋以上。在黑木耳生產(chǎn)中菌種是基礎(chǔ)資料，是影響產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素，優(yōu)良菌種的選用對整個產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著重要的作用。由于不同地區(qū)和生產(chǎn)廠家頻繁相互引種，自主命名，造成生產(chǎn)用菌種命名極為混亂。

針對這一現(xiàn)象，本文采用酯酶同工酶電泳技術(shù)，對生物學(xué)特性適宜伊春地區(qū)栽培的、商品性較好、產(chǎn)量較高的23個黑木耳品種遺傳背景進行分析，對它們進行鑒別，同時也為今后的遺傳育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及來源

從小興安嶺伊春地區(qū)收集得到23個黑木耳主栽品種，用于酯酶同工酶分析（見表1）。

1.2 設(shè)備

DYY-10電泳儀、WD-9412A恒溫循環(huán)器、DYCZ-28A電泳槽、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋、HH-B11-600-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱、TGL-16高速離心機、Gilson移液器、分析天平（精度0.01g、0.0001g各一臺）、研缽（備有研杵）等。

表1 供試菌種及其來源

1.3 試劑

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N，N-甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、核黃素、α－乙酸萘酯、β－乙酸萘酯、堅固藍RR鹽，以上試劑均購自Sangon（BBI分裝），其它試劑均為國產(chǎn)。

1.4 菌絲培養(yǎng)

1.4.1 培養(yǎng)基配方（LCYM）：葡萄糖20g，蛋白胨2g，酵母浸膏2g，硫酸鎂0.5g，磷酸氫二鉀1g，磷酸二氫鉀0.46g，蒸餾水定容1000mL。

1.4.2 培養(yǎng)條件：（25±1）℃避光，靜止在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20d。

1.5 酯酶同工酶檢測

1.5.1 樣品制備。準確稱取0.5g菌絲體，加入液氮研磨，將樣品收集于1.5mL離心管中，加入1.0mL樣品提取液，4℃下10000r／min離心10min，取其上清液與40%蔗糖溶液、溴酚藍指示劑按5∶1∶1的比例混合，混合液即為電泳樣品。

1.5.2 電泳檢測。向電泳槽中注用1×Tris－甘氨酸緩沖液，用微量進樣器取21μL電泳樣品樣品孔中，樣品先在穩(wěn)壓100V的條件下進行電泳，待樣品進入濃縮膠后，把電泳槽放入冰箱內(nèi)進行低溫電泳，待指示劑進入分離膠后，把電壓調(diào)到200V進行穩(wěn)壓電泳，最后當(dāng)溴酚藍指示劑距凝膠底部1cm時，停止電泳。

1.5.3 凝膠染色。倒出1×Tris－甘氨酸緩沖液，卸下膠條，于水中取出凝膠，浸入染色液，室溫下染色20min左右，用ddH2O沖洗凝膠，置于7%乙酸溶液中固定，照相（圖1、圖2）。

1.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計酯酶同工酶條帶，條帶的有無分別記為1和0，按Nei＆Li（1979）的方法計算各菌種之間的相似系數(shù)GS＝2Nij／（Ni＋Nj），式中Ni和Nj分別為I和J兩個菌種的總條帶數(shù)，Nij為兩材料的公共條帶數(shù)。獲得相似系數(shù)GS矩陣后，應(yīng)用NTSYS 2.10e軟件進行聚類分析，構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶酶譜分析

如圖1、圖2所示各菌種之間的酶帶顏色和寬窄也有差異，可分為四級：一級酶帶：色深而寬；二級酶帶：色較深而寬；三級酶帶：色較淺而窄；四級酶帶：色很淺而窄。酶帶顏色和寬窄的變化說明了酯酶同工酶的活性和含酶量的差異，色深而寬的酶帶酯酶同工酶的活性強、含量高，色淺而窄的酶帶酯酶同工酶的活性弱、含量低。

供試23個菌種進行酯酶同工酶電泳分析。酯酶同工酶譜帶數(shù)在5～10條，共分離出14條遷移率（Rf）不同的多態(tài)性酶帶，遷移率在0.29～0.85，譜帶穩(wěn)定，重復(fù)性高。

2.2 遺傳背景分析

根據(jù)電泳條帶的有、無，分別記為1或0，對穩(wěn)定、清晰的酶帶進行統(tǒng)計，輸入計算機，采用NTSYS 2.10e分析軟件中的STMQUAL程序計算遺傳相似系數(shù)，并建立樹狀圖（圖3）。

由圖3可見，一品黑、A1、長城1號三個菌株間的相似系數(shù)達1.0；A8、A4、特產(chǎn)1號三個菌株間的相似系數(shù)達1.0；特產(chǎn)6號、A3、林科3號、長白7號、匯豐1號、8129六個間相似系數(shù)達1.0。

在遺傳相似系數(shù)0.62水平上，23個黑木耳菌種聚為為A、B兩大類，其中A類在遺傳相似系數(shù)0.78水平上聚為Ⅰ、Ⅱ兩大類，Ⅰ類包括以下品種：一品黑、A1、長城1號、A8、A4、特產(chǎn)1號、特產(chǎn)5號、特產(chǎn)2號、黑29、銀珠1號、特產(chǎn)6號、A3、林科3號、長白7號、匯豐1號、8129、特產(chǎn)15號共17個菌株；Ⅱ類品種：A15；其中B類在遺傳相似系數(shù)0.75水平上聚為Ⅲ、Ⅳ兩大類，Ⅲ類包括以下品種：友好918、北青、林科6號、特產(chǎn)3號共四個菌種；Ⅳ類品種：神龍A8。

圖1 供試黑木耳菌種（編號1～12）酯酶同工酶電泳圖譜

圖2 供試黑木耳菌種（編號13～23）酯酶同工酶電泳圖譜

圖3 23個黑木耳菌種PAGE-EST分析聚類樹狀圖譜

3 討論

隨著生物技術(shù)和食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，同工酶電泳分析在食用菌遺傳學(xué)和菌種真實性鑒定中得到廣泛應(yīng)用，其中以酯酶同工酶和過氧化酶的應(yīng)用最多。在酯酶同工酶電泳試驗中，由于菌種的酯酶同工酶和其形態(tài)特征一樣都是菌種的基因型與環(huán)境效應(yīng)相互作用的綜合表現(xiàn)的結(jié)果，所以酯酶的活性受到外部環(huán)境影響比較大，并且具有明顯的組織特異性等特點。因此，在應(yīng)用其進行食用菌種質(zhì)鑒定、品種鑒別等有關(guān)研究工作中，要采用標(biāo)準化，在相同條件下進行分析，才能建立食用菌菌種的標(biāo)準酶譜和保證酯酶同工酶的穩(wěn)定性。

從供試菌種的酶譜帶型和聚類分析可以看出，部分菌種之間的帶型相似或者相同，相似系數(shù)也很高，甚至達到1.0，如一品黑、A1和長城1號；A8、A4和特產(chǎn)1號等一些品種可以初步確定這些菌種間親緣關(guān)系很近。由于菌絲代謝活動差異，酶的活性不同，酯酶同工酶的帶數(shù)和酶帶深淺、寬度等會出現(xiàn)差異，在酶帶實際統(tǒng)計分析中都會對分析結(jié)果產(chǎn)生影響，特別在聚類等分析中。在今后的研究中應(yīng)當(dāng)將PAGE-EST與ISSR、SRAP等標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合進行綜合分析。

本實驗表明，23個黑木耳菌種酯酶多態(tài)性比較高，共分離到不同遷移率的條帶14條，條帶類型比較豐富，多數(shù)菌種之間存在差異，在相同的實驗條件下（菌齡等因素），其穩(wěn)定性和重復(fù)性比較好，并且在一定程度上可以反應(yīng)出某些菌種之間存在同物異名現(xiàn)象。隨著《NY／T 1097-2006食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法》的頒布，酯酶同工酶電泳技術(shù)以其操作簡單、耗時短、費用低和重復(fù)性高等特點，在食用菌菌種的真實性鑒定和遺傳學(xué)等方面的研究依然有比較高的應(yīng)用價值。

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