隋毓秀 張志珺郭怡菁孫奕

近年的研究發(fā)現(xiàn)Notch1及其相關蛋白在成年動物腦內海馬區(qū)持續(xù)表達，表明在成熟分化的神經(jīng)系統(tǒng)中該信號通路仍然起著作用［1］。Breunig等［2］應用原位雜交技術在體發(fā)現(xiàn)，Notch1的過度表達促進神經(jīng)前體細胞增殖。Notch1基因敲除存在小鼠海馬再生障礙，LTP下降，且可為外源性Jag-1逆轉［3］。由此可見，Notch1信號系統(tǒng)對成年期中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生有重要作用。我們前期的研究通過慢性不可預見性溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)和孤養(yǎng)法建立抑郁大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與正常大鼠相比，抑郁大鼠海馬齒狀回Notch1信號通路蛋白及基因表達水平顯著降低，與同一部位的神經(jīng)干細胞增殖的減少并行［4］。提示Notch1信號通路有可能在抑郁大鼠神經(jīng)重塑障礙發(fā)揮作用。而氟西汀促進神經(jīng)再生與其抗抑郁效應相關。這些促使我們思考，慢性氟西汀干預提高神經(jīng)再生是否同樣伴隨著Notch1信號通路的改變。為了說明這一問題，我們應用大鼠腹腔注射氟西汀建立在體模型，測定大鼠海馬中BrdU陽性細胞數(shù)和Notch1信號通路各個因子的基因及蛋白表達水平的改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague-Dawley(SD)成年雄性大鼠，體質量在220～280 g之間。腹腔注射氟西汀(Fluoxetine，F(xiàn)lu)建立干預模型。選擇體重相近大鼠約40只，每組12只，隨機分為3組:對照組、14 d Flu干預組、28 d Flu干預組。干預組給予氟西汀(常州四藥)，蒸餾水配成質量濃度1 mL/mg的溶液，2 mg/kg，每日1次腹腔注射，對照組同時給予同等量生理鹽水，治療持續(xù)至14 d或28 d結束［5］。干預組和對照組大鼠每籠5只，在相同的室溫、光照條件下正常喂養(yǎng)，給藥時間為每日下午14:00。

將BrdU用生理鹽水配制成5 mg/mL的溶液，在應激開始和最后1 d分別腹腔注射(3×50 mg/kg;每8 h)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化和免疫熒光檢測海馬齒狀回神經(jīng)干細胞增殖、存活和分化 BrdU注射后2 h，戊巴比妥鈉深度麻醉大鼠。多聚甲醛PBS溶液灌注、固定、取腦，海馬連續(xù)冰凍切片，片厚30 μm。BrdU免疫組化:小鼠抗大鼠BrdU抗體(1∶500)，生物素化的羊抗小鼠IgG(1∶500)，辣根過氧化物酶復合物(1:100)，DAB顯色劑呈色，封片、鏡檢。BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標:小鼠抗大鼠 BrdU抗體(1∶200)，山羊抗小鼠 TRITC(1∶200)，兔抗 NeuN 抗體(1∶200)或兔抗 GFAP 抗體(1∶200)，山羊抗兔 FITC(1∶200)。

用Nikon CFM-500 E倒置熒光顯微鏡和圖象分析系統(tǒng)進行觀察與分析。采用盲法立體計數(shù)法計數(shù)海馬齒狀回的BrdU陽性細胞總數(shù)。每只大鼠每隔6張選取1張腦片，對海馬齒狀回，計數(shù)兩條顆粒細胞層的內側邊界和門區(qū)的BrdU陽性細胞。在400倍和1000倍的光鏡下計數(shù)，視野最邊界的細胞不在計數(shù)范圍內。計數(shù)每張腦切片BrdU陽性細胞數(shù)，相加后乘以6即得到每個大鼠海馬齒狀回的總BrdU陽性細胞數(shù)目(n=6)。免疫熒光:每只大鼠統(tǒng)計不少于50個BrdU陽性細胞，以雙標陽性占全部BrdU細胞的比例×100來表示(n=6)。

1.2.2 Real time PCR 和 Western blot檢測 Notch1 信號系統(tǒng)各因子基因表達和蛋白水平 應激結束后第2天斷頭處死大鼠，快速剝離海馬，機械勻漿后置于－80℃中保存?zhèn)溆?。用Triziol法提取總RNA，然后用逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為cDNA。構建聚合酶體系(詳見表1)。Taq酶(Promega)催化。熱循環(huán):95℃預熱5 min，35個循環(huán)(95℃ 10 s;57℃ 15 s;72℃ 20 s;85℃5 s)。各樣品目的基因和管家基因分別進行SYBR熒光實時定量聚合酶鏈反應，檢測Notch通路相關因子基因表達水平，各實驗組均取同樣條件下培養(yǎng)的3份標本進行檢測，取其平均值，結果表示為由梯度稀釋DNA標準曲線得到樣品目的基因校正后的相對含量(目的基因與內參比值)±標準差。

海馬組織經(jīng)蛋白質抽提試劑(1 mL抽提試劑中加入5 μL 蛋白酶抑制劑混合液，5 μL PMS F 和 5 μL 磷酸酶混合液)提取蛋白質?？捡R斯亮藍法測定蛋白濃度。經(jīng)變性取50 μg經(jīng)20%SDS-PAGE(十二烷基硫磺胺－聚丙烯酰胺)電泳，轉移到PVDF(聚偏二氟乙烯)，4℃封閉過夜，用一抗(rabbit anti-NICD，Hes1，Hes5，Jag1 and Beta-actin antibody，1 ∶1000，Santa Cruz)室溫孵育1 h，洗膜后加入辣根過氧化物標記的二抗(anti-rabbit IgG conjugated to horseradish peroxidase，HRP，1∶5000，Santa Cruz)。ECL(增強化學發(fā)光法)顯影，x光片暗室中感光，凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能儀器有限公司)進行掃描并記錄光密度強度。蛋白水平結果以相對灰度值表示，即目的基因與內參(βactin)灰度測量比值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)均以±s表示。采用單因素方差(one-way ANOVA)分析進行顯性檢驗，組間差異比較用Bonferroni法，檢驗水準 α=0.05。

表1 Notch通路各因子引物序列

2 結果

2.1 慢性氟西汀干預對大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖、存活和分化的影響

2.1.1 神經(jīng)干細胞的增殖 在氟西汀干預最后一天大鼠腹腔注射BrdU，以觀察氟西汀對海馬神經(jīng)干細胞增殖的影響。如圖1所示，BrdU陽性細胞主要位于亞顆粒細胞層，呈簇狀，形狀不一，提示正在進行分裂的不成熟細胞［5］。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組(2919.50±188.80)比較，F(xiàn)lu干預14 d組(3706.50±228.04)和Flu干預28 d(4334.33±217.48)組海馬BrdU陽性細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

2.1.2 神經(jīng)干細胞的存活 在氟西汀干預開始大鼠腹腔注射BrdU，以觀察氟西汀對海馬神經(jīng)干細胞存活和分化的影響。如圖2所示，BrdU陽性細胞形狀較為規(guī)整，呈園形或橢圓形，且BrdU陽性細胞的絕對值較觀察增殖狀態(tài)時少，提示經(jīng)4周生長、成熟，部分干細胞可能已凋亡，與既往研究結果一致［6］。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組(2404.50±148.77)相比，F(xiàn)lu干預 28 d組(3273.16±156.68)BrdU陽性細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

2.1.3 神經(jīng)干細胞的分化 神經(jīng)干細胞分化成為成熟的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞至少需28 d，因此我們氟西汀干預開始時大鼠腹腔注射BrdU(3×50 mg/kg;每8 h)，以觀察其分化情況。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組(71.63±10.21)相比，F(xiàn)lu干預28 d組(72.41±13.34)NeuN/BrdU比例無明顯差異(P＞0.05);與對照組(14.34±2.03)相比，F(xiàn)lu干預28 d組(18.21±2.60)GFAP/BrdU比例無明顯差異(P＞0.05)。(圖3)

2.2 慢性氟西汀干預對Notch1信號系統(tǒng)各因子基因表達和蛋白水平的影響

2.2.1 Real time PCR檢測Notch1信號通路各因子基因表達 如圖4所示，與對照組［NICDmRNA(0.30±0.03)，Hes1mRNA(0.53 ±0.03)，Hes5mRNA(0.21 ±0.02)，Jag1mRNA(1.04±0.07)］比較，F(xiàn)lu干預 14 d組［NICDmRNA(0.45±0.05)，Hes1mRNA(0.65±0.06)，Hes5mRNA(0.31 ±0.06)，Jag1mRNA(2.46 ±0.39)］和 Flu干預 28 d［NICDmRNA(0.42±0.03)，Hes1mRNA(0.85±0.06)，Hes5mRNA(0.39±0.02)，Jag1mRNA(3.21±0.34)］組Notch1信號通路各因子基因水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P ＜0.001)。

2.2.2 蛋白質印跡實驗 (Western blotting)檢測Notch1信號通路各因子(NICD、Hes1、Hes5、Jagged1)蛋白水平 如圖5所示，與對照組［NICD(2.36±0.17)，Jag1(2.33±0.31)］比較，F(xiàn)lu干預 14d組［NICD(3.20±0.25)，Jag1(2.86±0.25)］和 Flu干預28 d［NICD(3.40±0.19)，Jag1(3.35±0.14)］組Notch1信號通路蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01或P＜0.001)。與對照組Hes5(0.89±0.20)比較，F(xiàn)lu干預14 d組 Hes5(0.95±0.09)和 Flu干預28 d Hes5(1.14±0.09)蛋白水平無改變，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與對照組Hes1(1.09±0.25)比較，F(xiàn)lu干預14 d組Hes1(1.32±0.22)蛋白水平無顯著改變(P＞0.05)，F(xiàn)lu干預28 d Hes1(1.43±0.13)蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

圖1 慢性Flu干預對海馬齒狀回神經(jīng)干細胞增殖的影響。A、B、C分別顯示對照組、Flu干預14 d組和Flu干預28 d組海馬BrdU陽性細胞(10×)

圖2 慢性Flu干預對海馬齒狀回神經(jīng)干細胞存活的影響。A、B分別顯示經(jīng)過28 d Flu干預后，對照組、Flu干預28d組海馬的存活細胞(10×)

圖3 海馬齒狀回神經(jīng)干細胞的分化(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標)(20×)

圖4 Real time PCR檢測慢性Flu干預后Notch1信號通路各因子基因表達，與對照組比較，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

圖5 Western blot檢測慢性Flu干預后Notch1信號通路各因子蛋白水平。A:蛋白表達圖片，B:各因子蛋白水平;與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001

3 討論

本實驗應用BrdU觀察慢性氟西汀干預對正常大鼠海馬齒狀回神經(jīng)再生的影響。在連續(xù)給藥14 d或28 d后，大鼠腹腔注射BrdU標記，行免疫組織化學染色。圖1顯示，氟西汀干預下海馬BrdU陽性細胞進行性增加，說明慢性氟西汀干預增加神經(jīng)干細胞的增殖，且隨用藥時間的延長，促增殖作用愈加明顯。BrdU注射28 d以后，行免疫組化染色觀察新生細胞的存活。結果顯示，與對照組相比，F(xiàn)lu28 d組BrdU陽性細胞顯著增加。說明慢性氟西汀具有保護神經(jīng)干細胞抗凋亡的作用，增加了神經(jīng)干細胞的存活。應用成熟神經(jīng)元標志物NeuN或神經(jīng)膠質細胞標志物GFAP，同時與BrdU免疫熒光雙標顯示神經(jīng)干細胞的分化。結果未發(fā)現(xiàn)慢性氟西汀干預對神經(jīng)干細胞分化的影響。以上實驗結果說明，慢性(2～4周)氟西汀干預可以促進齒狀回的神經(jīng)發(fā)生，引起正常大鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細胞增殖和存活的上調，而對分化無明顯影響。提示氟西汀的神經(jīng)保護作用是確切的，與臨床起效時間一致，而且宜長期用藥以確保能全面發(fā)揮保護功效。大量實驗已證實，長期(2～4周)氟西汀處理增加BrdU陽性細胞比例是通過促進細胞增殖實現(xiàn)的，對細胞分化沒有任何影響［7－8］，本實驗結果再次驗證了這一現(xiàn)象。

氟西汀能促進成年動物腦內神經(jīng)干細胞的增殖和存活，一定程度上改善應激造成的神經(jīng)功能缺損［9］，但至今對其內源性神經(jīng)干細胞增殖的分子機制不甚了解。本研究以慢性氟西汀干預正常大鼠作為研究對象，選擇在用藥后14 d和28 d兩個時間點檢測海馬Notch通路各因子的表達，以闡明整個通路的功能狀態(tài)。結果提示慢性氟西汀干預大鼠海馬的Notch1信號通路呈現(xiàn)進行性表達變化，即干預后14 d和28 d Notch信號各因子基因表達均顯著增高。提示氟西汀干預狀態(tài)下Notch信號通路功能的上調。而在蛋白水平，干預后14 d和28 d僅發(fā)現(xiàn)NICD和Jag1的顯著升高，Hes1在氟西汀干預28 d后有顯著升高，Hes5無明顯改變，個別因子變化的不同步性可能與蛋白表達的延遲有關。而配體和受體表達的升高仍可說明該信號通路的激活。

對Notch通路的研究顯示，Notch信號具有促進神經(jīng)干細胞增殖、維持和向神經(jīng)膠質細胞分化的作用。NICD是Notch通路的胞內活性片段，代表信號系統(tǒng)的激活，該因子的表達增加強有力的提示通路功能的上調。Hes1、Hes5作為Notch信號途徑的靶基因，較之其它因子(如Hes-3)，與維持神經(jīng)干細胞在未分化狀態(tài)的聯(lián)系更為緊密。并且發(fā)現(xiàn)在哺乳動物大腦發(fā)育中HES-5可以作為特定標記物來區(qū)分神經(jīng)干細胞與其它祖細胞［10］。因而，Hes1和Hes5的表達增加，與促進神經(jīng)干細胞增殖有密切關系。研究表明，Jag1可通過作用于Notch受體和其下游效應器(信號分子Shh等)來促進神經(jīng)干細胞的生存1［11－13］。Jag1的表達增加，可能通過Shh發(fā)揮其促進海馬神經(jīng)干細胞增殖的作用。Notch信號通路的激活促進了神經(jīng)干細胞的增殖和存活，與此一致，我們在免疫組化中試驗發(fā)現(xiàn)隨氟西汀干預時間的持續(xù)，神經(jīng)干細胞增殖和存活的數(shù)目進行性增加，提示Notch參與了氟西汀調節(jié)海馬齒狀回神經(jīng)再生的上調。但本實驗未發(fā)現(xiàn)膠質細胞分化的增多，提示還有其他調控因子參與了海馬神經(jīng)再生的調節(jié)。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，慢性氟西汀干預下Notch1信號通路功能上調的同時，海馬神經(jīng)干細胞的增殖、存活增加。二者發(fā)生的一致性，結合近年來有關Notch信號通路在成年后神經(jīng)再生作用的研究背景，提示Notch1信號系統(tǒng)可能與氟西汀干預下海馬的神經(jīng)重塑障礙有關。我們將在進一步的研究中檢測氟西汀干預應激大鼠后Notch通路的功能狀態(tài)，研究其與海馬神經(jīng)再生的關系，這將有助于進一步闡明抑郁狀態(tài)下神經(jīng)增殖、分化的基本機制，尋找到新的抗抑郁治療的靶點。

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