楊兵勛，沈春香，王 增，陳立鉆，樓正家，吳人照，夏克中

(浙江天皇藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310012)

HPLC法測(cè)定鐵皮石斛飲料中D-甘露糖的含量

楊兵勛，沈春香，王 增，陳立鉆，樓正家，吳人照，夏克中

(浙江天皇藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 310012)

目的：建立鐵皮石斛飲料中D-甘露糖(D-Man)含量的測(cè)定方法。方法：樣品分別經(jīng)乙醇沉淀、鹽酸水解和衍生化處理。色譜柱使用Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)； 20mmol/L乙酸銨-乙腈溶液(80.5: 19.5)為流動(dòng)相；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。結(jié)果：樣品中西洋參多糖對(duì)甘露糖含量測(cè)定無(wú)干擾；樣品中D-甘露糖在7.815～312.6μg/mL 范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系均良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9997；樣品回收率為99.66%，RSD為1.76%(n=6)。結(jié)論：本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、靈敏、精確、重現(xiàn)性好，可用于本品多糖組成中D-Man含量的測(cè)定。

鐵皮石斛飲料；D-甘露糖；高效液相色譜法；含量測(cè)定

鐵皮石斛飲料(Dendrobium officinale Kimuraet Migo beverage，DOB)主要原料為鐵皮石斛和西洋參，是采用水提等制備工藝制備而成的保健飲料，具有養(yǎng)胃生津、滋陰降火、提高機(jī)體免疫功能的功效，其主要功效成分為鐵皮石斛多糖。文獻(xiàn)報(bào)道，鐵皮石斛多糖主要含有多糖Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，相對(duì)分子質(zhì)量分別為1000000、500000和120000，多糖水解物主要含甘露糖(Man)、葡萄糖，還含有微量的阿拉伯糖和木糖[1-4]。Man等單糖成分多為己糖結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)無(wú)吸收，直接采用紫外法或HPLC法無(wú)法測(cè)定。目前對(duì)Man等單糖類(lèi)成分多采用示差折光檢測(cè)器，但示差檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度低，且不能梯度洗脫[5]。本研究采用先將DOB中鐵皮石斛多糖水解成單糖，并與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)進(jìn)行衍生化后，再行HPLC法測(cè)定DOB中D-Man的含量。該方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，旨在為功能性飲料品控提供一種有效的控制手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鐵皮石斛飲料(批號(hào)：091021-1)及缺鐵皮石斛的陰性制劑飲料 浙江天皇藥業(yè)有限公司。

乙腈(色譜純) 德國(guó)Merck公司；對(duì)照品D-甘露糖(D-Man) (批號(hào)：200301，含量：99%) 中國(guó)藥品生物制品檢定所；內(nèi)標(biāo)鹽酸氨基葡萄糖(HAG，純度99.0%～101.0%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，分析純) 上海晶純?cè)噭┯邢薰?。水為亞沸高純?自制)；其余試劑均為分析純。

1100液相色譜儀、色譜工作站(A.09.01版) 美國(guó)Agilent公司。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取D-Man對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)HAG適量，加水制成每1mL含D-Man 0.1mg、內(nèi)標(biāo)鹽酸氨基葡萄糖0.1mg的溶液，并進(jìn)行衍生化，分離收集上清液，即得對(duì)照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

樣品提取：精密吸取鐵皮石斛飲料1mL于具塞試管中，精密加入無(wú)水乙醇4mL，放置1h，4000r/min離心20min，倒出上清液，再加入80%乙醇溶液5mL洗滌，4000r/min離心20min，倒出上清液，沉淀置水浴揮去殘留乙醇，再精密加入內(nèi)標(biāo)HAG溶液(0.2mg/mL)3mL，水浴溶解混勻，得多糖樣品提取液。

樣品水解：取含多糖樣品提取液1mL置于安瓿瓶中，加3mol/L HCl溶液0.5mL，封口，110℃反應(yīng)1h，冷卻后用NaOH中和至中性，得樣品水解液。

樣品衍生化：取樣品水解溶液、0.3mol/L NaOH溶液、0.5mol/L PMP甲醇溶液各400μL，置于具塞離心管中，密塞，70℃衍生化反應(yīng)100min，放冷，加0.3mol/L HCl溶液0.5mL，用2mL三氯甲烷萃取，共2次，水層液離心，收集上清液，即得供試品溶液。

1.2.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：20mmol/L乙酸銨-乙腈溶液(80.5:19.5)；流速：1.0mL/ min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；進(jìn)樣量10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)

取缺鐵皮石斛的陰性制劑飲料，照1.2.2節(jié)方法制備缺鐵皮石斛飲料陰性對(duì)照溶液；分別吸取對(duì)照品、供試品和缺鐵皮石斛飲料陰性對(duì)照溶液各10μL，分別進(jìn)樣，進(jìn)行色譜測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，色譜峰分離度良好，且陰性對(duì)照溶液對(duì)D-Man的測(cè)定無(wú)干擾(圖1)，表明本法專(zhuān)屬性強(qiáng)。

圖1 Man HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of iron free DOB (containing no internal standard), control (containing no internal standard), test sample and control (containing internal standard)

2.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取鐵皮石斛飲料，照1.2.2節(jié)方法分別制備6份樣品，按1.2.3節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果所測(cè)D-Man的峰面積RSD為0.72%，表明本法重復(fù)性好。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定D-Man峰面積，其RSD為0.29%，說(shuō)明儀器的精密度符合要求。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液連續(xù)5d進(jìn)樣測(cè)定D-Man峰面積，結(jié)果5d所測(cè)結(jié)果RSD為0.18%，表明本樣品溶液在室溫條件下5d內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.5 線(xiàn)性關(guān)系考察

分別配制質(zhì)量濃度為0.007815、0.015630、0.031260、0.062520、0.125040、0.312600mg/mL的D-Man工作溶液，內(nèi)含鹽酸氨基葡萄糖質(zhì)量濃度為0.12186mg/mL，按1.2.2節(jié)方法分別進(jìn)行衍生化，并按照1.2.3節(jié)色譜條件測(cè)定DMan峰面積。以D-Man質(zhì)量濃度(C，mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖，其回歸方程為：A=1.3641C-0.0239，r=0.9997，說(shuō)明D-Man在7.815～312.6μg/mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系均良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密吸取鐵皮石斛飲料6份，每份各 0.5mL，分別置于具塞試管中，按照1.2.2節(jié)方法提取，向提取物中各精密加入內(nèi)標(biāo)鹽酸氨基葡萄糖溶液0.12186mg/mL、DMan 0.06252mg/mL 的混合溶液3mL，再按照1.2.2節(jié)方法制備樣品。最后按1.2.2節(jié)色譜條件測(cè)定D-Man峰面積，并計(jì)算回收率(表1)。結(jié)果顯示，6份樣品所測(cè)平均回收率為99.66%，RSD為1.76%，表明本方法回收率符合要求。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Spike recovery of the method

2.7 樣品中D-Man含量的測(cè)定

取不同批號(hào)的鐵皮石斛飲料，按1.2.2節(jié)方法處理，照1.2.3節(jié)色譜條件測(cè)定，并計(jì)算產(chǎn)品中D-Man的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鐵皮石斛飲料中D-Man含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 2 Man concentrations in different batches of DOB determined by HPLC (n=3)

3 討 論

DOB是采用水提等制備工藝將鐵皮石斛和西洋參制備而成的保健飲料，其主要活性成分為鐵皮石斛多糖。D-Man是鐵皮石斛多糖主要構(gòu)成成分之一，其分子為己糖結(jié)構(gòu)，在紫外區(qū)無(wú)吸收，直接采用紫外法或HPLC法無(wú)法測(cè)定。目前對(duì)Man等糖類(lèi)成分多采用示差折光檢測(cè)器，但示差檢測(cè)器檢測(cè)靈敏度低，且不能梯度洗脫。通過(guò)衍生化使糖類(lèi)化合物生成具有紫外吸收或能發(fā)射熒光的物質(zhì)是提高糖類(lèi)HPLC檢測(cè)靈敏度的主要手段[5-7]。

Man與PMP中吡唑啉酮基作用生成PMP-Man衍生物，衍生物中含有苯基結(jié)構(gòu)，在250nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)紫外吸收。同時(shí)，衍生化后改變了糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，更有助于分離。本研究采用先將DOB中鐵皮石斛多糖水解成單糖后與PMP進(jìn)行衍生化，再行HPLC法測(cè)定D-Man的含量。結(jié)果顯示，本法不僅靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)、分離度高，可適用于本品質(zhì)控，而且采用先將鐵皮石斛多糖水解成單糖后再測(cè)定D-Man的含量，避免了制劑中人為加入的干擾。

本研究對(duì)鐵皮石斛多糖水解條件進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，對(duì)本法制樣量用3mol/L HCl 0.5mL，110℃反應(yīng)1h即可水解完全；此外，本研究還對(duì)D-Man衍生化的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用本實(shí)驗(yàn)衍生化條件可使D-Man衍生化反應(yīng)徹底。

鐵皮石斛多糖是鐵皮石斛的主要活性成分，含量高達(dá)29%以上[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，石斛類(lèi)藥材還含有微量的石斛堿、石斛醚、毛蘭素、鼓槌聯(lián)芐等小分子物質(zhì)[10-15]；目前，鐵皮石斛藥材及其制劑僅采用硫酸苯酚顯色法測(cè)定多糖含量進(jìn)行質(zhì)量控制。該法顯著缺點(diǎn)是不能準(zhǔn)確判斷所測(cè)多糖的來(lái)源，即鐵皮石斛多糖，專(zhuān)屬性差；最近，比較研究32種石斛中多糖含量、多糖構(gòu)成等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛多糖中的D-Man、葡萄糖、半乳糖具有較恒定的比例關(guān)系。鐵皮石斛多糖中以上3種單糖質(zhì)量比為140:35:1，且主要單糖構(gòu)成不同于其他石斛(另文發(fā)表)。因此，對(duì)DOB以及鐵皮石斛類(lèi)其他制劑采用測(cè)定多糖、多糖中主要單糖的含量及其比例關(guān)系等綜合手段將是未來(lái)鐵皮石斛類(lèi)制劑質(zhì)量控制發(fā)展的方向之一。

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Determination of Mannose in Dendrobium officinale Kimuraet Migo Beverage by HPLC

YANG Bing-xun，SHEN Chun-xiang，WANG Zeng，CHEN Li-zuan，LOU Zheng-jia，WU Ren-zhao，XIA Ke-zhong
(Zhejiang Tianhuang Medicinal Plant Pharmaceutical Co. Ltd., Hangzhou 310012, China)

Objective: To establish a HPLC method to determine the content of D-mannose (D-Man) in Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage (DOB). Methods: Ethanol precipitation followed by hydrochloric acid hydrolysis and derivatization was carried out for sample preparation. Mannose was separated on an Agilent Eclipse XDB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5μm) using a mobile phase made up of 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (80.5:19.5, V/V) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 250 nm. Results: No interference was found from Panacis quinquefolium in DOB. The linear range of Man was between 7.815μg/mL and 312.6μg/mL (r = 0.9997). The average recovery was 99.66% (RSD 1.76%, n = 6). Conclusion: This method is specific, sensitive, accurate and reproducible and may therefore be applicable for the determination of D-Man in DOB.

Dendrobium officinale Kimura et Migo beverage；D-mannose；HPLC

R917

A

1002-6630(2011)08-0275-03

2010-06-25

楊兵勛(1963—)，男，高級(jí)工程師，博士，主要從事藥品及保健食品研究。E-mail：Yangbx001@yahoo.com.cn