郝 帥，閆艾慧，姜學(xué)鈞

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)院 耳鼻咽喉科，遼寧 沈陽 110001)

順鉑以其廣譜高效性在抗腫瘤治療中被普遍應(yīng)用，但其腎毒性和耳毒性的副作用使得目前臨床應(yīng)用被嚴(yán)格控制[1]，特別是順鉑可造成聽功能永久性損傷[2]。本研究組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)孕晚期順鉑暴露致子代豚鼠毛細(xì)胞損傷及聽力下降，但孕期順鉑暴露致子代出生后毛細(xì)胞損傷的研究未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)順鉑能否誘導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡，為順鉑耳毒性研究及其防護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

順鉑注射劑為齊魯制藥產(chǎn)品，兔抗Caspase-3多克隆抗體為美國(guó)Cell Signalling Techenology公司產(chǎn)品，TUNEL試劑盒為美國(guó)BD Biosciences公司產(chǎn)品；冰凍切片機(jī)位德國(guó)SLEE公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為日本Olympus光學(xué)工業(yè)產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康白色紅目受孕豚鼠12只(體重600～700 g)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部提供。雙側(cè)耳廓反射靈敏，在安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-0009；使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2003-0013。

1.3 動(dòng)物分組與處理

隨機(jī)分成兩組，每組6只，從孕50 d至56 d連續(xù)腹膜內(nèi)注射：(1)對(duì)照組：生理鹽水1.5 mg/kg·d；(2)順鉑組：順鉑1.5 mg/kg·d。子代出生后14 d，分離仔鼠右側(cè)耳蝸，行TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色。

1.4 耳蝸冰凍切片制備

快速打開胸腔，左心室穿刺，接灌流液，右心耳剪開。先以4℃生理鹽水經(jīng)心臟灌流，待右心耳處流出液體為無色時(shí)，改以4℃新鮮配置的4%多聚甲醛磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH=7.4)約300 mL灌流固定?？焖贁囝^，取雙側(cè)聽泡4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%甲酸-甲酸鈉常溫脫鈣1周。30%蔗糖4℃過夜，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物冰凍切片包埋劑包埋，恒冷箱切片機(jī)沿蝸軸平行方向行10 μm厚連續(xù)切片。

1.5 Caspase-3免疫組化檢測(cè)

冰凍切片干燥及過氧化物酶阻斷后，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，3次。滴加山羊血清封閉，室溫孵育50 min，滴加一抗，4℃過夜。PBS沖洗5 min，3次。滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育50 min。PBS沖洗5 min，3次。滴加鏈霉素親和素過氧化物酶溶液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片。在400倍光鏡下行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做到計(jì)數(shù)區(qū)域相同。將每個(gè)標(biāo)本共3個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)取平均值，做為該標(biāo)本的陽性細(xì)胞數(shù)，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 TUNEL染色

冰凍切片干燥及過氧化物酶阻斷后，室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，3次。0.1 mol/L TBS 1∶100新鮮稀釋蛋白酶K 37℃消化10 min，按每張切片取末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)和DIG-d-UTP各1 μL，加10 μL抗體稀釋液，每片加標(biāo)記液20 μL，濕盒37℃孵育2 h，PBS沖洗5 min，3次。滴加封閉液，每片50 μL，室溫孵育50 min，PBS沖洗5 min，3次。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，每片50 μL，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min，3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精梯度脫水，二甲苯透明，甘油封片。光鏡下觀察TUNEL陽性反應(yīng)細(xì)胞并計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 順鉑對(duì)豚鼠母體生殖指標(biāo)及仔鼠體重的影響

兩組在母體生殖指標(biāo)和子代體重間比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。見表1。

表1 母體生殖指標(biāo)和子代體重比較

2.2 順鉑對(duì)子代豚鼠Caspase-3在耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)的影響

順鉑組子代豚鼠出生后14 d，在耳蝸毛細(xì)胞可見棕黃色顆粒(A，黑色箭頭)，Caspase-3陽性染色明顯；對(duì)照組陽性染色不明顯(B)。見圖1。

2.3 順鉑對(duì)子代豚鼠耳蝸毛細(xì)凋亡的影響

順鉑組(A)子代豚鼠出生后14 d，耳蝸部分毛細(xì)胞核呈棕褐色染色，大小不一，形態(tài)不規(guī)整且排列紊亂，呈明顯凋亡；對(duì)照組(B)核內(nèi)無棕褐色著染,形態(tài)規(guī)整,排列整齊,陽性染色不明顯。見圖2。

3 討 論

順鉑造成聽功能損傷的副作用已得到廣泛證實(shí)，順鉑耳毒性損傷機(jī)制可通過多種途徑表現(xiàn)，即直接損傷內(nèi)耳蓄積、影響內(nèi)耳代謝、改變血清電解質(zhì)平衡及氧化應(yīng)激損傷等[3]。本研究采用低劑量孕晚期給藥，借以模擬人群病理狀態(tài)。哺乳動(dòng)物孕期毛細(xì)胞的正常分化，對(duì)其成熟后聽功能建立非常重要[4]。順鉑暴露可造成機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，從而導(dǎo)致機(jī)體生理狀況改變[5]。但本研究結(jié)果顯示，順鉑并未影響豚鼠母體產(chǎn)子數(shù)和子代體重，這可能與給藥劑量、方式及給藥持續(xù)時(shí)間有關(guān)。本研究所采用劑量為1.5 mg/kg·d，孕晚期連續(xù)7 d給藥，該劑量及給藥方式不會(huì)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中引起明顯聽力損傷[6]，而且在停藥4周后外毛細(xì)胞可有部分恢復(fù)[7]，耳蝸功能在8周后可恢復(fù)[8]。由此證明，本研究所采用順鉑劑量對(duì)母鼠是可代償?shù)摹?/p>

圖1 子代豚鼠毛細(xì)胞Caspase-3表達(dá)(免疫組化染色 400×)

圖2 子代豚鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡(TUNEL染色 400×)

但本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可經(jīng)胎盤誘導(dǎo)子代豚鼠耳蝸毛細(xì)胞凋亡發(fā)生。TUNEL染色是對(duì)完整的凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，通過檢測(cè)細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)階段，由細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶激活所造成的DNA片段的3’羥基末端，確定細(xì)胞凋亡的發(fā)生，用以反映細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征[9]。Caspase-3是Fas通道細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的核心蛋白，在凋亡的啟動(dòng)過程中發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是最重要的執(zhí)行者，它由上游的Caspase(Caspase-8、Caspase-9或Caspase-10)激活并水解為活性酶形式，Caspase-3特異性地激活核酸內(nèi)切酶，后者被釋放出來，隨后引起DNA迅速片段化[10]，對(duì)細(xì)胞凋亡是必需條件。抑制Caspase-3酶活性或拮抗Caspase-3功能可使細(xì)胞凋亡受抑。本研究結(jié)果顯示，順鉑暴露誘導(dǎo)子代豚鼠Caspase-3在耳蝸毛細(xì)胞表達(dá)增加。由此提示，順鉑可經(jīng)胎盤損傷子代耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育，可能是通過觸發(fā)Caspase-3參與的級(jí)聯(lián)效應(yīng)，繼而活化引起子代毛細(xì)胞形態(tài)上的改變，從而促進(jìn)凋亡完成。

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