李斯寧，李 玲，王長(zhǎng)智

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 大連116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116027)

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)，又稱(chēng)子宮體癌，是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的三大惡性腫瘤之一，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%。近年來(lái)，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。作為不穩(wěn)定細(xì)胞，子宮內(nèi)膜細(xì)胞周期性的脫落與增殖，伴隨DNA復(fù)制，與穩(wěn)定細(xì)胞以及永久性細(xì)胞相比，其基因損傷的幾率較高。因此，子宮內(nèi)膜細(xì)胞在復(fù)制過(guò)程中具有較高的修復(fù)依賴(lài)性。若基因發(fā)生損傷，修復(fù)系統(tǒng)則發(fā)揮其作用，維持基因的穩(wěn)定性。當(dāng)基因損傷無(wú)法修復(fù)時(shí)，基因突變產(chǎn)生，突變產(chǎn)物的累積是腫瘤發(fā)生的原因之一。在人體內(nèi)存在多種基因修復(fù)方式，DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生不同類(lèi)型的損傷都會(huì)有相應(yīng)的修復(fù)系統(tǒng)來(lái)修復(fù)這種損傷，即修復(fù)的種類(lèi)可提示DNA損傷的類(lèi)型。p53是研究最為廣泛的抑癌基因，其突變是多種腫瘤發(fā)生的主要原因。p53的突變是目前對(duì)子宮內(nèi)膜癌的研究中已明確的分子生物學(xué)改變[2]。由于野生型的P53蛋白半衰期較短，因此，目前認(rèn)為通過(guò)免疫組織化學(xué)方法可以檢測(cè)出的P53蛋白大多是突變型的p53。突變型p53失去了對(duì)腫瘤的抑制作用，反而促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。因此，以已知的p53突變?yōu)橹笜?biāo)，通過(guò)檢測(cè)不同種類(lèi)的修復(fù)方式所表達(dá)的蛋白與突變型p53的關(guān)系，推測(cè)導(dǎo)致p53突變的原因。hMSH2蛋白是錯(cuò)配修復(fù)蛋白的主要成員[3]。當(dāng)細(xì)胞中的基因錯(cuò)配增加時(shí)，hMSH2蛋白的表達(dá)將反饋性增高。MGMT蛋白則具有中和修復(fù)DNA烷化損傷的作用[4]。當(dāng)DNA出現(xiàn)烷化損傷時(shí)，MGMT蛋白表達(dá)上調(diào)。本研究用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常子宮內(nèi)膜與子宮內(nèi)膜癌組織中的hMSH2、MGMT兩種修復(fù)蛋白的表達(dá)，通過(guò)分析二者表達(dá)與p53表達(dá)的關(guān)系，探討子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2007～2009年期間診斷明確的子宮內(nèi)膜癌手術(shù)切除標(biāo)本66例。其中，子宮內(nèi)膜樣腺癌62例，其他類(lèi)型4例；病理分級(jí)I級(jí)30例，II級(jí)24例，III級(jí)12例；無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移53例，有淋巴轉(zhuǎn)移13例；淺肌層浸潤(rùn)50例，深肌層浸潤(rùn)16例。所有病例均未經(jīng)放療、化療和性激素治療。正常子宮內(nèi)膜組織選取自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，其中包括分泌期與增生期子宮內(nèi)膜。

1.2 主要試劑

鼠抗人hMSH2單克隆抗體：Zymed公司(美國(guó))；兔抗人p53單克隆抗體： Santa Cruz公司(美國(guó))；鼠抗人MGMT單克隆抗體：北京中山試劑公司；SP試劑盒和DAB顯色劑：北京中山試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)石蠟切片脫蠟至水；(2)蒸餾水沖洗，3%H2O2室溫孵育；(3)pH6.0檸檬酸緩沖液行抗原修復(fù)；(4)加一抗 4℃過(guò)夜；(5)加二抗 37℃孵育；(6)加入辣根過(guò)氧化物酶；(7)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

hMSH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)或兩者均出現(xiàn)棕黃色顆粒，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野或500個(gè)細(xì)胞，按照染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色記為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：陰性為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比的乘積≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性[5]。MGMT蛋白陽(yáng)性細(xì)胞染色為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，P53陽(yáng)性細(xì)胞染色為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，陽(yáng)性率(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與腫瘤細(xì)胞總數(shù)之比)≥20%為陽(yáng)性表達(dá)，<20%為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用SPSS17.0軟件包分析，采用χ2檢驗(yàn)和四格表確切概率法處理數(shù)據(jù)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hMSH2 、MGMT及P53在子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)

hMSH2、MGMT 、P53在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的陽(yáng)性率均明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有顯著性意義(P<0.05)(表1)。三者在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)分別見(jiàn)圖1～3。

2.2 P53蛋白的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移以及浸潤(rùn)深度之間的關(guān)系

P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在不同病理分級(jí)的子宮內(nèi)膜癌中差異有顯著性意義(P<0.05)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)的陽(yáng)性表達(dá)率為35.2%，而Ⅲ級(jí)的陽(yáng)性表達(dá)率為83.3%；有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)；淺肌層浸潤(rùn)組陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于深肌層浸潤(rùn)組(P<0.05)(表2)。

2.3 子宮內(nèi)膜癌中P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與hMSH2、MGMT陽(yáng)性表達(dá)率之間的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌中，hMSH2蛋白在P53陽(yáng)性組的表達(dá)率為96.6%，與陰性組的70.3%比較差異有顯著性意義，P53蛋白與hMSH2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(χ2=7.548，P<0.05)；MGMT蛋白在P53陽(yáng)性組的表達(dá)率為65.5%,與陰性組的75.7%比較差異無(wú)顯著性意義，P53蛋白與MGMT蛋白表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

表1 hMSH2、MGMT 、P53在子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜中的陽(yáng)性表達(dá)率

圖1 P53蛋白在子宮內(nèi)膜癌的陽(yáng)性表達(dá)(SP 400×)

圖2 hMSH2蛋白在子宮內(nèi)膜癌的陽(yáng)性表達(dá)(SP 400×)

圖3 MGMT蛋白在子宮內(nèi)膜癌的陽(yáng)性表達(dá)(SP 400×)

表2 P53在不同病理分級(jí)、有否淋巴轉(zhuǎn)移、不同浸潤(rùn)深度的子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)率

表3 子宮內(nèi)膜癌中P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率與hMSH2、MGMT陽(yáng)性表達(dá)率之間的關(guān)系

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)上多數(shù)為腺癌。雖然其病因尚不明確，但多數(shù)研究認(rèn)為與持續(xù)雌激素刺激和遺傳等因素有關(guān)。同其他惡性腫瘤一樣，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生也是一個(gè)包括癌基因激活、抑癌基因突變與失活等多因素參與的漸進(jìn)過(guò)程。由于子宮內(nèi)膜細(xì)胞是不穩(wěn)定細(xì)胞，其DNA復(fù)制較其他細(xì)胞活躍，在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生損傷的機(jī)會(huì)較高，相應(yīng)的修復(fù)系統(tǒng)功能正常對(duì)維持基因組穩(wěn)定性十分重要。本研究探討了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生過(guò)程中DNA修復(fù)基因hMSH2和MGMT的表達(dá)對(duì)抑癌基因p53突變的影響，期望對(duì)子宮內(nèi)膜癌發(fā)生機(jī)制的研究有所幫助。

目前，有研究認(rèn)為p53是潛在的腫瘤診斷標(biāo)志物。p53基因分為野生型和突變型。野生型p53基因是一種抑癌基因,它的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用，p53是一個(gè)重要的抗癌基因，它促使癌細(xì)胞凋亡,防止癌變,還具有幫助細(xì)胞基因修復(fù)缺陷的功能。這種功能對(duì)于受化療藥物作用而受傷的癌細(xì)胞,則起修復(fù)作用,而不是使癌細(xì)胞凋亡,造成被修復(fù)的癌細(xì)胞在治療后容易產(chǎn)生新的變異進(jìn)而導(dǎo)致新的腫瘤產(chǎn)生[6]。因此，p53基因突變后不僅失去正常抑癌作用,還可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化[7]。hMSH2基因是第1個(gè)被分離出來(lái)的人類(lèi)錯(cuò)配修復(fù)基因，其編碼的蛋白具有識(shí)別并參與堿基錯(cuò)配修復(fù)的功能，從而能夠維持基因組的穩(wěn)定性[8]。Leach等[9]在對(duì)散發(fā)性腫瘤(如膀朧上皮惡性腫瘤)的研究中發(fā)現(xiàn)hMSH2蛋白的表達(dá)常表現(xiàn)為異常升高。董莉等[10]也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)hMSH2在子宮內(nèi)膜癌中出現(xiàn)這種高表達(dá)的現(xiàn)象，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。這可能是癌細(xì)胞增殖較正常細(xì)胞活躍，DNA發(fā)生錯(cuò)配幾率增高，hMSH2的表達(dá)代償性增高的結(jié)果。MGMT是一種修復(fù)基因，其表達(dá)的蛋白產(chǎn)物主要是修復(fù)由烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷。正常情況下MGMT可將DNA鏈中烷基移到自身半胱氨酸的殘基上，從而修復(fù)烷化劑導(dǎo)致的DNA損傷[11]。許多學(xué)者研究表明，惡性腫瘤中的MGMT均有表達(dá)[11-13]，而本實(shí)驗(yàn)中MGMT蛋白表達(dá)率在子宮內(nèi)膜癌組也顯著高于正常子宮內(nèi)膜組，可能由于細(xì)胞發(fā)生過(guò)多的甲基化損傷而導(dǎo)致癌變，這些損傷需要MGMT表達(dá)上調(diào)來(lái)修復(fù)。因而甲基化損傷可能是子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的一個(gè)原因。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示P53蛋白、hMSH2蛋白和MGMT蛋白表達(dá)率在子宮內(nèi)膜癌組均顯著高于正常子宮內(nèi)膜組，提示P53蛋白可作為子宮內(nèi)膜癌變的標(biāo)志物之一；聯(lián)合檢測(cè)P53、hMSH2和MGMT蛋白可能有助于子宮內(nèi)膜癌的診斷。

本研究還發(fā)現(xiàn)病理分級(jí)為Ⅲ級(jí)的子宮內(nèi)膜癌P53蛋白表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)內(nèi)膜癌，在深肌層浸潤(rùn)組明顯高于淺肌層浸潤(rùn)組。許多學(xué)者分析，高度惡性的子宮內(nèi)膜癌與低度惡性子宮內(nèi)膜癌P53表達(dá)有明顯差異，P53蛋白表達(dá)的量可作為良惡性程度判斷的指標(biāo)之一[14]。提示P53蛋白的陽(yáng)性表達(dá)可視為惡性腫瘤的信號(hào)，p53突變的原因一直是探討基因突變與腫瘤發(fā)生相關(guān)性的重要問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)P53蛋白陽(yáng)性組與陰性組中修復(fù)基因的表達(dá)差異來(lái)反應(yīng)DNA損傷情況，從而推測(cè)突變發(fā)生的原因。

本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hMSH2蛋白在P53陽(yáng)性組的表達(dá)率顯著高于陰性組。子宮內(nèi)膜癌中的P53表達(dá)與hMSH2蛋白的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，即P53表達(dá)高的組中hMSH2也高表達(dá)。MGMT蛋白在P53陽(yáng)性組的表達(dá)率與陰性組比較差異無(wú)顯著性意義，P53蛋白與MGMT蛋白表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性。存在p53突變的子宮內(nèi)膜癌組織中hMSH2蛋白表達(dá)較高，說(shuō)明突變過(guò)程中存在大量的DNA錯(cuò)配， hMSH2蛋白針對(duì)p53基因突變中的錯(cuò)配反應(yīng)性表達(dá)上調(diào)，以修復(fù)受損基因。由此可見(jiàn)，在p53的突變過(guò)程中基因錯(cuò)配累積可能是其發(fā)生的原因之一。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的根本原因之一可能是由于基因錯(cuò)配累積所引起。

hMSH2、MGMT、p53在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著一定的作用，聯(lián)合檢測(cè)P53與hMSH2蛋白也可為子宮內(nèi)膜癌的診斷和預(yù)后評(píng)估提供重要線索。在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生過(guò)程中p53突變的原因可能是惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的DNA錯(cuò)配。

參考文獻(xiàn):

[1] Jemal A,Siegel R,Ward E,et al.Cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2007,57(1):43-66.

[2] LAX S F,KENDALL B,TASHIRO H,et al.The trequency of p53,Krasmutations,and microsatellite instabiliey differs in utenine endonetroid and serous carcinoma.Evidence of diseinctmol-ecdlargenetic pathwas[J].Cancer,2000,88: 814-824.

[3] Lipkin SM,Wang V,Jacoby R,et al.MLH3:a DNA mismatch repair gene associated with ammalian microsatel-lite instability[J].Nat Genet,2000,24(1): 27-35.

[4] Dolan ME,Schilsky RL.Silence is golden gene hypernethylation and survival in large-cell lymphoma[J].National Carcinoma Institute,2002,94(1):6-7.

[5] 許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)結(jié)果的判定[J].中國(guó)癌癥雜志，1996，6(4):229-231.

[6] 歐陽(yáng)艷.p53和pten在子宮內(nèi)膜癌的表達(dá)及其意義[J].西南軍醫(yī),2010，512(3)：421-422.

[7] Hoffman WH,Biade S,Zilfou JT,et al.Transcriptional repression of the anti-apoptotic survivin gene by wild type P53[J].J Biol Chem,2002,277:3247-3257.

[8] 王怡璐,李梅,呂申.子宮內(nèi)膜癌hMSH2及P53蛋白表達(dá)的意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,27(6):427-429.

[9] Leach FS，Polyak K，Burrell M，et al，Expression of the human mismatch repair gene hMSH2 in normal and neoplastic tissues[J].Cancer,1996,56:235-240.

[10] 董莉,王文革,王莉.錯(cuò)配修復(fù)基因hMLH1、hMSH2及p53在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及意義[J].實(shí)用藥物與臨床,2007,10(2):71-73.

[11] 費(fèi)建東,王曉寅,薄愛(ài)華.胃癌中MGMT和EGFR表達(dá)及其意義[J].Modern oncology,2010,18(7):1346-1348.

[12] 趙健,雷建賓,姜海濤.MGMT在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2008,16(1):26-29.

[13] 斯向東,舒暢,徐賓.O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與P53蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2009,25(24):4116-4118.

[14] Sigurd F，Brian Kendall，Hironori Tashiro，et a1.The frequency of P53，k-ras mutations and micosatellite instability differs in uterine endometrial cancer cells [J].Cancer,2000,88(4): 814-824.