韋 鴻，呂海辰，李 梅，馮 璐，王朝暉，呂 申

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)中心，遼寧 大連 116027；2.復(fù)旦大學(xué) 上海醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)07級(jí)8年制，上海 200032)

肺癌是影響人類生存的重大疾病之一。每年死于肺癌的人數(shù)占癌癥死亡總數(shù)的17.8%[1]，其中大約80%為非小細(xì)胞肺癌。近年來，分子靶向藥物酪氨酸激酶受體抑制劑TKI(tyrosine kinase inhibitor)治療肺癌的臨床成績(jī)已得到廣泛關(guān)注。該藥的作用機(jī)制為通過抑制EGFR(epidermal growth factor receptor)酪氨酸磷酸化，阻止EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，TKI僅對(duì)腫瘤細(xì)胞EGFR外顯子有突變的肺癌患者治療有效。然而，仍有一些患者的腫瘤細(xì)胞雖有EGFR外顯子突變，但對(duì)TKI的治療并不敏感，其原因被認(rèn)為是該轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的下游信號(hào)因子Kras或Braf異常激活造成腫瘤細(xì)胞持續(xù)增殖[2,3]。據(jù)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌患者中常有Kras和Braf的突變[4]。提示在篩選TKI治療敏感的肺癌患者時(shí)，應(yīng)聯(lián)合檢測(cè)EGFR、Kras和Braf的突變情況。一般認(rèn)為，基因的突變常與蛋白異常表達(dá)相關(guān)。迄今，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的Kras及Braf蛋白表達(dá)狀況及其與肺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系尚不明確。本研究用免疫組化方法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的Kras及Braf蛋白表達(dá)狀況，分析其與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系，期望對(duì)篩選TKI治療敏感的人群提供幫助。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

收集2007～2009年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一、第二醫(yī)院及其他幾家醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本126例。其中，男性71例，女性55例；年齡36～80歲，平均(61.85±8.96)歲，≤62歲66例，>62歲60例；吸煙42例，不吸煙84例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移64例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例；腺癌85例，其中高中分化53例，低分化32例；鱗癌36例，其中高中分化20例，低分化16例；腺鱗癌5例，其中高中分化1例，低分化4例。選其中26例癌旁組織作為對(duì)照。

1.2 研究方法與判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法：Kras與Braf蛋白檢測(cè)均采用免疫組化SP法，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行，微波修復(fù)、DAB顯色、沖洗、蘇木素復(fù)染、封片。取已知陽性組織作陽性對(duì)照，以PBS替代一抗作陰性對(duì)照。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)：在高倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，依陽性細(xì)胞百分比做半定量分析。陽性細(xì)胞百分比≤25 %記為1分、25 %～50 %記為2分、51 %～75 %記為3分、>75 %為4分；細(xì)胞漿無色記為0分、淡黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分；最后將二者相乘，積分≤3分為陰性，>3分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Chi-square檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)分析，結(jié)果均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Kras和Braf蛋白在肺癌組織和癌旁組織的表達(dá)情況

Kras蛋白陽性表達(dá)率在肺癌組與癌旁組分別為40.5%(51/126)與42.3%(11/26)，兩者間差異無顯著性意義(P>0.05)；Braf蛋白陽性表達(dá)率在肺癌組與癌旁組分別為26.2%(33/126)與26.9%(7/26)，兩者間的差異亦無顯著性意義(P>0.05)。

2.2 Kras及Braf蛋白分別在同一病例癌與癌旁組織表達(dá)的相關(guān)性

Kras蛋白在同一病例癌與癌旁組織間的表達(dá)顯著相關(guān)(r=0.456,P<0.05)；Braf蛋白在同病例癌與癌旁組織間的表達(dá)不相關(guān)(r=0.079,P>0.05)。見表1。

表1 Kras及Braf蛋白分別在同病例癌與癌旁組織表達(dá)的相關(guān)性

2.3 肺癌組織Kras及Braf蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

Kras蛋白表達(dá)與肺癌患者的性別、年齡、吸煙與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織學(xué)類型和分化程度無關(guān)(P>0.05)；Braf蛋白表達(dá)與患者吸煙及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05)。Braf蛋白陽性表達(dá)率在吸煙與不吸煙患者分別為11.9%(5/42)與33.3%(28/84)，兩者間的差異有顯著性意義(P<0.05)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者分別為14.1%(9/64)與38.7%(24/62),兩者間的差異有顯著性意義(P<0.05)。Braf蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡及腫瘤組織學(xué)類型和分化程度無關(guān)(P>0.05)。另外，本實(shí)驗(yàn)將同一例肺癌標(biāo)本中無論是僅出現(xiàn)Kras蛋白陽性表達(dá)或僅出現(xiàn)Braf蛋白陽性表達(dá)均記為該標(biāo)本蛋白陽性表達(dá)，結(jié)果顯示蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及腫瘤組織學(xué)類型和分化程度均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 肺癌組織Kras及Braf蛋白的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

2.4 肺癌組織Kras與Braf蛋白表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)相關(guān)性檢驗(yàn)，在肺癌組織中Kras與Braf蛋白間的表達(dá)不相關(guān)(r=0.024,P>0.05)。

3 討 論

非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素調(diào)控的過程，有多種基因參與腫瘤細(xì)胞的增生、分化和凋亡。Kras基因編碼21 kDa鳥苷酸結(jié)合蛋白，有三種密切相關(guān)的Ras蛋白，即Krast、Hrast、Nras構(gòu)成小分子GTP酶的Ras超家族成員，它們可以作為分子開關(guān)，傳遞細(xì)胞外信號(hào)從而引發(fā)一系列基本的細(xì)胞過程，包括增殖、存活和分化[5,6]。當(dāng)前Ras蛋白的生化模型提示，Ras以GDP結(jié)合的非活化形式存在，當(dāng)與GTP結(jié)合則被啟動(dòng)，Kras的啟動(dòng)將進(jìn)一步激活Ras-Raf-MEK-ERK這條信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞的異常增生，促使腫瘤形成。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)Kras蛋白表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，雖然Kras蛋白在非小細(xì)胞肺癌的癌組織與癌旁組織間表達(dá)的差異無顯著性意義，但在同病例的癌與癌旁組織間的表達(dá)呈正相關(guān)，即在癌組織有Kras蛋白表達(dá)的病例，其癌旁組織也有該蛋白的表達(dá)。一方面，Kras蛋白的表達(dá)狀況可能與患者間的個(gè)體差異有關(guān)；另一方面，也提示肺組織在腫瘤細(xì)胞形成之前已經(jīng)有Kras蛋白表達(dá)，Kras蛋白在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生及演進(jìn)中的作用及臨床意義值得進(jìn)一步探討。另外，基因突變常會(huì)導(dǎo)致蛋白的異常表達(dá)。有關(guān)研究表明，有Kras突變的非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)TKI治療不敏感，那么Kras蛋白異常表達(dá)是否也會(huì)影響TKI療效還需要深入研究，這將對(duì)TKI治療的敏感人群篩選提供幫助。

圖1 A：肺腺癌Kras蛋白陽性表達(dá)(SP 200×)；B：肺腺癌Kras蛋白陰性表達(dá)(SP 200×)；C：肺腺癌Braf蛋白陽性表達(dá)(SP 200×)；D：肺腺癌Braf蛋白陰性表達(dá)(SP 200×)

Braf基因是1988年由Ikawa等首先在人類尤文肉瘤中發(fā)現(xiàn)并克隆確認(rèn)的，一種能轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞且有活性的DNA序列，因其與Craf和Araf有相當(dāng)高的同源性，故稱其為Braf。Braf是Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，它主要通過有絲蛋白激酶通路中的絲/蘇氨酸蛋白激酶來發(fā)揮作用，該酶將細(xì)胞表面的受體和Ras蛋白通過MEK和ERK與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子相連接，啟動(dòng)多種因子參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，Braf蛋白在非小細(xì)胞肺癌患者的癌組織與癌旁組織間表達(dá)的差異無顯著性意義，在同一病例癌與癌旁組織間的表達(dá)也不相關(guān),但Braf蛋白的表達(dá)與患者吸煙與否顯著相關(guān)，不吸煙患者Braf蛋白的表達(dá)顯著高于吸煙患者。蛋白的異常表達(dá)常與突變相關(guān)，但有報(bào)道稱在不吸煙肺癌患者中并沒有檢測(cè)到Braf突變[8]，且不吸煙患者對(duì)TKI的治療敏感，這提示在不吸煙非小細(xì)胞肺癌患者中即使Braf蛋白高表達(dá)，Braf也可能會(huì)無突變，并且此類患者可能會(huì)對(duì)TKI的治療敏感。本研究還發(fā)現(xiàn)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者Braf蛋白表達(dá)顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，這提示Braf蛋白表達(dá)狀況可能會(huì)指示腫瘤細(xì)胞的惡性程度，即Braf蛋白表達(dá)越高，該腫瘤細(xì)胞惡性程度越低。對(duì)Kras與Braf蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)二者之間的表達(dá)不相關(guān)，這提示了在非小細(xì)胞肺癌中Kras與Braf蛋白的異常表達(dá)是相互獨(dú)立發(fā)生的。有關(guān)研究表明，在肺癌中Kras與Braf的突變也是相互獨(dú)立發(fā)生的，且不會(huì)同時(shí)發(fā)生在同一例患者當(dāng)中[9]。因此，若能將Kras與Braf蛋白的表達(dá)與基因突變情況相結(jié)合進(jìn)行深入的研究，可能會(huì)對(duì)指導(dǎo)應(yīng)用TKI有一定幫助。

非小細(xì)胞肺癌Kras及Braf蛋白在不同患者間的表達(dá)狀況不同，對(duì)腫瘤的發(fā)生及演進(jìn)有一定影響，通過檢測(cè)二者的表達(dá)將會(huì)對(duì)篩選TKI藥物敏感人群有所幫助。

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