江青東

(鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校動物醫(yī)學(xué)系,河南鄭州450011)

催乳素(prolactin,PRL)是垂體前葉嗜酸粒細胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素,由199個氨基酸殘基所組成。大量研究表明,PRL在乳腺發(fā)育、啟動泌乳和維持泌乳中都起著重要的作用,它協(xié)同卵巢類固醇激素(E和P)促進乳腺小葉腺泡的生長和上皮細胞的增殖。許多研究者先后用切除垂體或以溴隱亭抑制PRL分泌的方法,證明了垂體PRL的存在是E2和P促進乳腺發(fā)育的重要條件。同時用激素替代或垂體移植方法,證明了PRL促進乳腺發(fā)育的作用[1-3]。PRL對乳腺生長和分化及奶生產(chǎn)發(fā)展和維持發(fā)揮關(guān)鍵作用。在腎上腺-性腺-垂體切除的大鼠,使用大劑量的PRL和GH,能引起乳腺導(dǎo)管的生長和分叉以及中等程度的小葉腺泡發(fā)育,可促使乳的生成,并激發(fā)泌乳[4]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集 SD大鼠,購自河南省實驗動物中心,體重250 g。在12 h光照和12 h黑暗的條件下喂養(yǎng),環(huán)境溫度20℃～25℃,自由采食和飲水。大鼠顆粒飼料購自河南省實驗動物中心。并根據(jù)陰道涂片決定動情周期的不同階段,于發(fā)情前期處女鼠與雄性大鼠進行同籠飼養(yǎng)(1∶2),雌雄合籠后次日上午在陰道涂片中發(fā)現(xiàn)精子者定為妊娠第1天,妊娠鼠單個飼養(yǎng),分別于6、12、18 d處死大鼠;分娩的當(dāng)天看作泌乳0 d,分別于 6、12、18 d處死大鼠;另外處死處女鼠;每組6只。處死大鼠后取血液離心取上清,乳腺組織入液氮速凍,后置-80℃冰箱保存待測。

1.2 試劑和儀器 生理鹽水、BSA蛋白、考馬斯亮藍G-250、乙醇、動物血清、雌激素放免藥盒(購自北京北方生物技術(shù)研究所);勻漿器、離心機、752紫外分光光度計,SN-695型智能放免γ測量儀,液氮罐,-80℃冰箱等。

1.3 組織勻漿液的制備 取適宜大小的組織塊,立即稱重后于生理鹽水(1～2 mL)中于勻漿器中制成勻漿,12 000 r/min(4℃)離心20 min,取上清液置-20℃待測。

1.4 勻漿液中蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮藍染色法測定蛋白質(zhì)濃度,考馬斯亮藍在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)和染料結(jié)合符合比爾定律 ,因此可以通過測定染料在595 nm處光吸收的增加量得到與其結(jié)合的蛋白質(zhì)量。該法簡便迅速、干擾物質(zhì)少、靈敏度高(比 Lowry法靈敏4倍)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:取11支試管,按照表1依次加入試劑,搖勻,5 min后測定各管OD595 nm,蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),以O(shè)D595 nm值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

未知樣品蛋白質(zhì)濃度的測定:測定方法同上,取合適的未知樣品體積于2支干凈試管中,按上法測定OD595 nm值,使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi),根據(jù)所測定的OD595nm值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量,從而計算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度(mg/mL)。

1.5 放免分析 催乳素放免試劑盒(由北京北方生物技術(shù)研究所提供)包括:prl標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S6:0-4 000 μ IU/mL)、兔抗-Prl抗體 、125I-PRL、驢抗兔免疫分離劑組成。樣本采用雙管重復(fù)測定,依照試劑盒說明書進行。加完液體混勻,室溫放置15 min,3 500 r/min(4℃)離心15 min,棄上清。用γ-計數(shù)器測定沉淀cpm數(shù)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算勻漿液中催乳素的含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 根據(jù)勻漿液中蛋白質(zhì)濃度及放射免疫所測E2含量的結(jié)果,將樣本中E2的含量換算成ng/mg蛋白單位。所有數(shù)據(jù)均用ˉX+SD表示,并采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計,多組間比較用方差分析F檢驗,組間兩兩比較用SNK檢驗。

2 結(jié)果

乳腺組織和血液中催乳素含量 不同時期大鼠乳腺組織及血液中PRL的含量見表2。

表2 不同時期大鼠乳腺組織及血液中PRL含量(+S,n=6)

表2 不同時期大鼠乳腺組織及血液中PRL含量(+S,n=6)

注:組間不同字母為差異顯著(P＜0.05)

?

圖1 大鼠不同時期血液中催乳素變化規(guī)律

血清PRL水平以處女期最高,妊娠開始急劇下降,隨著妊娠進行又逐漸增加,分娩后隨著泌乳進行期漸漸下降。處女期與其余各期差異顯著(P＜0.05),整個妊娠期間以妊娠18 d為最高,且妊娠期間差異不顯著(P＞0.05),泌乳6 d明顯高于泌乳12 d、18 d(P＜0.05),泌乳12 d、18 d明顯低于妊娠各期水平(P＜0.05);乳腺PRL變化模式與血清的變化不一致,處女期最高,隨妊娠下降,泌乳期相對穩(wěn)定,變化不大。處女期與其余各期差異顯著(P＜0.05),妊娠6 d水平僅明顯低于處女期(P＜0.05),而顯著高于其余各期(P＜0.05)。

圖2 大鼠不同時期乳腺組織中催乳素變化規(guī)律

3 討論

成年動物的乳腺一生中要經(jīng)歷發(fā)情周期中的增生和凋亡周期[5]。青春期雌激素可促進乳腺導(dǎo)管發(fā)育,孕酮促進乳腺腺泡的發(fā)育[7]。而妊娠期小葉腺泡的發(fā)育以及小葉上皮細胞的增殖則需要PRL;同時成年動物乳腺在動情期中的周期性生長也需PRL起作用,以保證乳腺對雌激素和孕酮的反應(yīng)性[7],早年的研究表明[8],施行二(切除下丘腦和卵巢)和三切除(切除下丘腦、卵巢和腎上腺)手術(shù)的大鼠,聯(lián)合應(yīng)用雌激素+孕酮+PRL,可使乳腺小葉發(fā)育至妊娠早期水平。從試驗結(jié)果中可以看出PRL無論在乳腺組織還是在血清里,其含量均在處女期為最高,PRL變化趨勢與曹廣文等(1985)報道相矛盾,這可能是因為催乳素在促進乳腺發(fā)育及啟動泌乳的過程中,胎盤泌乳素(PL)的分泌增加而起到了主要作用,進而表現(xiàn)出泌乳前的發(fā)動作用。從試驗結(jié)果可看出,在泌乳過程中,血液PRL濃度趨勢降低,而在乳腺組織PRL含量有先增后減的趨勢。這與張志群等[7]發(fā)現(xiàn),分娩后的山羊隨著外周血液PRL濃度升高,乳腺組織RNA含量也有增加,基本一致。假孕兔僅用PRL,就能引起乳腺腺泡分化,高爾基囊膨大,腺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪球和蛋白質(zhì)膠粒,分娩前血漿PRL水平的驟然升高。從試驗結(jié)果中可以看出妊娠期間PRL在血液中有遞增趨勢,而在乳腺組織中則有遞減趨勢,表明在妊娠期促進乳腺發(fā)育及啟動泌乳的過程中,胎盤泌乳素起到了重要的作用,而非催乳素在起決定作用;泌乳期間隨捉泌乳期的結(jié)束,PRL在血液中逐漸降低,說明PRL在啟動和維持泌乳方面起到了重要作用,此結(jié)論與有關(guān)報道的相一致。從試驗結(jié)果中整個妊娠過程中PRL在血液中保持較高水平,而在乳腺組織中則相反;整個泌乳階段PRL在血液中保持較低水平,而在乳腺組織中則相反;可得出隨著乳腺的發(fā)育,組織中的PRL變化趨于穩(wěn)定,而在血液中則變化明顯,這說明胎盤催乳素的分泌在妊娠階段起主要作用,并主要分布在血液里。

[1]Cowie A T.The induction of mammary g rowth in hypophy sectomized goat[J].J Endocr,1966,34:185-195.

[2]Snith K L.Hormone induced Lactation in bovine I.Lactational performone following injections of oestradiol and progesterone[J].J Dairy Sci,1973,56:738-743.

[3]Schams D.T he role of steroid hormones,Prolactin and placental lactogen on mammary gland development inewes and heifers[J].J Endocr,1984,102:121-130.

[4]Prall O W,Rogan E M,Sutherland R L,et al.c-Myc or cyclin d1 mimics estrogen effects on cyclin E-cdk2 activation and cell cycle reentry[J].J M ol Cell Biol,1998,18:4499-4508.

[5]Schedin P,Mitrenga T,Kaeck M.Estrous cy cle regulation of mammary epithelial cell proliferation,differentiation,and death in the Sprague-Dawley rat:a model for investigating the role of estrous cycling in mammary carcinogenesis[J].J M ammary Gland Biol Neoplasia,2000,5:211-225.

[6]Chen C L,Weiss N S,Newcomb P,et al.Hormone replacement therapy in relation to breast cancer[J].JAMA,2002,287:734-741.

[7]張志群,韓正康.用活體取樣研究山羊分娩前后乳腺的發(fā)育及分泌[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1988,11(2):102.

[8]Spring-verlag.Early effects of prolactin on lactating rabbit mammary gland[J].J Cells and Tissue Res,1978,187:25-43.