伍 莉,朱周福

(1.西南大學榮昌校區(qū)動物醫(yī)學系,重慶榮昌402460;2.重慶市獸藥工程技術研究中心,重慶北碚400715)

鴨病毒性肝炎是雛鴨的一種傳播迅速的高致死性病毒病,本病可由5種不同類型的病毒引起,稱為鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)的1、2、3型和鴨星狀病毒的2個型。這5種獨立的病原體,對患病雛鴨造成相似的病理變化,均以引起肝炎為其主要特征。DHAV-1呈世界性分布,在我國,1958～1962年發(fā)生了DHAV-1的初次流行,20世紀80年代初期起本病在我國再次流行,其后,各地疫情此起彼伏。本試驗以DHAV-1標準毒株感染健康的花邊鴨,對感染雛鴨的肝、脾、腎、胰等器官組織變化進行動態(tài)觀察,旨在尋求DHAV-1的病理變化規(guī)律,為該病發(fā)病機理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 100只3日齡未接種疫苗、其親代也未接種鴨病毒性肝炎疫苗的健康花邊雛鴨,購于榮昌縣清升鎮(zhèn)孵化場,經(jīng)預試驗證明該場雛鴨為鴨肝炎病毒敏感鴨。隨機分成感染組50只,對照組50只,并分別飼養(yǎng),自由采食、飲水,飼養(yǎng)觀察2 d,鴨群精神狀態(tài)、采食、飲水均正常,羽毛蓬松有光澤。

1.2 標準毒株 DHAV-1型標準強毒株,由重慶永健生物技術有限公司實驗中心提供,經(jīng)雛鴨半數(shù)致死量試驗,確定毒株的半數(shù)致死量LD50為10-4/mL。

1.3 人工感染方法 6日齡花邊鴨雛鴨50只,每只雛鴨腿部肌肉注射上述制備的肝組織勻漿0.2 mL;對照組雛鴨50只,每只雛鴨腿部肌肉注射滅菌生理鹽水0.2 mL。

1.4 組織取材及處理 于感染后 12、24、48、72、96、168、336 h,在對照組和感染組中各取5只雛鴨剖殺,分別取其心 、腦、肝、脾 、腎 、胰、腔上囊等組織,包音氏(Bouin′s)固定液固定,常規(guī)石蠟包埋切片,H.E.染色,光鏡觀察。

2 結果

2.1 臨床癥狀 臨床觀察發(fā)現(xiàn),雛鴨接毒前精神狀況良好,采食、飲水正常。接毒后12～24 h,大部分雛鴨表現(xiàn)呆滯,精神沉郁,垂翅縮頸拱背,不愿走動,采食量、飲水量明顯減少。一部分鴨出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,表現(xiàn)為精神緊張,對外來刺激敏感,抽搐,運動失調(diào)等;一部分鴨開始臥地打滾,頭往后背,兩腿呈劃水樣姿勢。神經(jīng)癥狀出現(xiàn)后20～120 min雛鴨陸續(xù)死亡,死亡雛鴨表現(xiàn)為典型的角弓反張姿勢。雛鴨從接毒后24 h開始死亡,死亡高峰期為接毒后24～48 h,接毒后96 h死亡停止。

2.2 剖檢病理變化 死亡雛鴨表現(xiàn)為:肝臟腫大、質(zhì)地易脆,呈淡紅色,表面密布有點狀、斑點狀出血或壞死灶(見中插彩版圖1A),切開肝臟可見切面外翻、多汁,結構模糊;膽囊明顯腫大,膽汁充盈呈墨綠色;心包積液,心肌色淡變軟,心室擴張;脾臟柔軟、腫大,表面呈紅白相間的斑駁狀,切面外翻、多汁(見中插彩版圖1B);胰臟腫大,表面有出血,有的表面分布細小的白色病灶;腎臟呈黃白色、腫大,表面血管明顯(見中插彩版圖1C);部分雛鴨腔上囊腫大;腦表面血管明顯易見、淤血,擴張如樹枝狀(見中插彩版圖1D);其他臟器未見眼觀變化。

2.3 病理組織學變化 肝臟:接毒后24 h雛鴨,肝細胞輕度腫脹、變性,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡,輕度淤血,嚴重者呈氣球樣,胞核淡染、濃縮或消失,病變肝組織間分布有大量聚集成團的紅細胞,局部組織有炎性細胞浸潤(中性粒細胞和淋巴細胞為主)(見中插彩版圖1E)。接毒后48 h,肝細胞高度腫脹,多數(shù)細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大的空泡,并見有局灶性出血和嗜酸性小體。接毒后72～168 h,肝細胞呈廣泛嚴重的水泡變性,匯管區(qū)小膽管增生,淋巴細胞浸潤。

對照組雛鴨肝組織結構正常,未見異常組織病理變化。

胰臟:接毒后24 h,腺泡之間水腫,血管擴張、充血,在血管周圍有大量淋巴樣細胞呈結節(jié)狀或彌漫性增生(見中插彩版圖1F)。接毒后24～48 h,胰臟均出現(xiàn)大小不等的壞死灶,腺細胞呈均質(zhì)紅染,其中可見濃縮或碎裂的細胞核,在血管或胰島附近出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤。接毒后48 h,胰腺細胞間分布的空泡數(shù)量明顯增多,有大小不一的一個至多個壞死灶,壞死灶中有淋巴細胞及中性粒細胞浸潤;接毒后72～168 h,胰腺外分泌細胞間的空泡數(shù)量逐漸減少,但可見胰腺血管壁增厚,血管內(nèi)皮細胞腫脹,突出于管腔,血管周圍和胰腺細胞間也出現(xiàn)中性粒細胞和淋巴細胞浸潤,數(shù)量逐漸增多。接毒后336 h,胰腺細胞間空泡消失,但細胞及血管周圍有明顯炎性細胞浸潤。

對照組雛鴨胰臟結構正常,未見異常組織病理變化。

脾臟:接毒后24 h,脾臟組織結構紊亂,紅白髓不易分辯,網(wǎng)狀細胞腫大呈氣球樣,胞核濃縮、碎裂甚至消失(見中插彩版圖1G)。接毒后48 h,脾臟除有上述病變外,還表現(xiàn)為單核巨噬細胞活躍,在脾組織及血管中有大量的含吞噬顆粒的巨噬細胞和多核巨細胞。接毒后72～168 h,脾臟紅、白髓結構清楚,脾小體明顯且體積增大、數(shù)量增多,淋巴細胞數(shù)目增多。

對照組雛鴨脾臟結構正常,未見異常組織病理變化。

腎臟:感染后不同時期雛鴨,腎臟均表現(xiàn)較一致的病變,可見大部分腎小管結構紊亂,嚴重淤血,腎小管上皮細胞腫脹、脫落,細胞質(zhì)內(nèi)有大小不一的空泡,核固縮,管腔縮小至消失,尤以接毒后24 h,受損的腎小管數(shù)量多,范圍廣,程度嚴重。有的腎小管上皮細胞細胞質(zhì)溶解,細胞核消失(見中插彩版圖1H),腎小管僅殘存基底膜;有的腎小管擴張,管腔內(nèi)有圓形均質(zhì)紅染物,有的腎小體淤血,有蛋白漿液滲出;在腎小葉邊緣有聚集成團的紅細胞和淋巴細胞;血管內(nèi)充滿紅細胞。

對照組雛鴨腎臟結構正常,未見異常組織病理變化。

3 討論

3.1 鴨病毒性肝炎的病理變化特點 本試驗對死亡雛鴨的組織病理學檢查結果表明,鴨肝炎病毒主要侵害肝、胰、脾、腎等組織,造成實質(zhì)器官變性壞死,并在不同階段呈現(xiàn)較明顯的差異。接毒后12 h,這些臟器組織以變性為主;接毒后24 h呈現(xiàn)明顯的壞死性病變;而接毒后72～168 h,則出現(xiàn)較為明顯的增生性變化。試驗中DHAV-1感染雛鴨引起鴨肝炎的發(fā)生,疾病潛伏期短、發(fā)病急、病程短,此結果與蘇敬良[2]和胡薛英等[3]人報道的結果基本一致。結合其他學者[4-5]所作DHAV-1感染雛鴨的血清及肝組織生化指標的研究結果分析,接毒后24 h,血清生化指標表現(xiàn)為轉氨酶升高等特性,此時病毒在各器官組織中廣泛分布,機體結構與功能均致嚴重的病理損傷;但接毒72 h后,血清指標漸趨正常,病毒分布亦減少。綜合上述動態(tài)變化規(guī)律,不難解釋在臨床上為何雛鴨感染DHAV-1后死亡高峰為24～48 h,而72 h后,病鴨死亡逐漸減少。

3.2 鴨病毒性肝炎引起組織病變的原因 據(jù)目前所知,脾臟受抗原刺激引起細胞免疫反應時,T淋巴細胞大量增殖,動脈周圍淋巴鞘明顯增厚[6]。本試驗研究顯示,在接毒后24 h,脾淋巴細胞明顯減少,網(wǎng)狀細胞變性、壞死,表明此時脾臟受損,免疫功能受到抑制,因而病毒大量增殖。隨感染時間延長,接毒后72 h,脾臟脾小體體積增大、淋巴細胞數(shù)目增多,表明機體的免疫反應增強。據(jù)Davis和Hanant報道2日齡鴨免疫后4 d可產(chǎn)生中和抗體,新生雛鴨肌肉注射DHAV-1型肝炎病毒的毒株后3 d內(nèi)產(chǎn)生抵抗力[7],此時可能正是抗體水平升高的時候。由于免疫功能的增強,使病毒增殖受到限制,機體受損的組織細胞開始修復,血液某些生化指標逐漸趨于正常,因而促使機體趨于恢復。殷震等[8]認為,體液免疫是抗 DHAV-1感染的主要因素,所以在DVH發(fā)病之后,注射高免血清和高免卵黃液等輸入抗體的方法可以治療該病,有效地控制疾病繼續(xù)發(fā)展。

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