姚華偉,范學(xué)政,徐 璐,陳 鍇,黃 偉,沙 莎,孟 萌,鄭 然,王 琴

(1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院,重慶榮昌402460;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬瘟參考實驗室,北京海淀100081)

豬瘟(CSF)是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種豬的高度致死性、接觸性傳染病[1]。根據(jù)OIE制定的《陸生動物衛(wèi)生法典》2009年版,CSF被列為必須報告的疫病之一,在我國被列為“一類動物疫病”。豬瘟病毒的常規(guī)檢測方法存在耗時、敏感性低、特異性差等缺點,且不能區(qū)分豬瘟野毒株和疫苗株。本實驗室建立了豬瘟病毒熒光定量PCR方法(CSFVFQ-PCR)用于檢測所有豬瘟病毒,還建立了特異性檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的熒光定量PCR方法(HCLV-FQ-PCR),均具有快速、敏感、特異等優(yōu)點;實驗室優(yōu)化的歐盟豬瘟參考實驗室CSFV-RT-nPCR,也是國際上常用的檢測CSFV的方法之一。本試驗將上述3種方法應(yīng)用于田間發(fā)病仔豬的檢測,以探索發(fā)病仔豬免疫疫苗前后的帶毒情況,并在田間病例中驗證3種檢測方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 河北省某地區(qū)發(fā)病仔豬47頭,1月齡左右。首次送檢樣品經(jīng)實驗室檢測,PRRSV、PRV、PPV、BVDV 和PCV-2病原及抗體均為陰性,有3頭豬樣本檢測顯示為豬瘟病原陽性,豬瘟抗體陰性,其后每隔7～10 d送檢此批仔豬血樣。

1.2 檢測方法

1.2.1 CSFV-RT-nPCR檢測方法 所用引物為歐盟豬瘟參考實驗室推薦[1-2],經(jīng)本實驗室優(yōu)化后使用。將RT-nPCR陽性產(chǎn)物進行測序,用于豬瘟分子流行病學(xué)[4-5]、遺傳進化分析和豬瘟病原診斷。

1.2.2 CSFV-FQ-PCR檢測方法 為本實驗室建立,用于檢測包括豬瘟疫苗株在內(nèi)的所有豬瘟病毒。1.2.3 HCLV-FQ-PCR檢測方法 為本實驗室建立,用于特異性的檢測豬瘟兔化弱毒疫苗。

1.2.4 檢測方案 以首次送檢日期為第1天。第1天和第13天的血樣采用CSFV-RT-nPCR進行檢測,其中第13天有5頭死亡豬送檢樣品。第16天農(nóng)戶自行免疫豬瘟疫苗,免疫后定期送樣,直至注射疫苗后81 d。所有送檢樣品分別采用CSFV-RT-nPCR、CSFV-FQ-PCR和 HCLV-FQ-PCR 3種檢測方法進行跟蹤檢測豬瘟病毒,將CSFV-RT-nPCR陽性產(chǎn)物測序并進行流行病學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟疫苗免疫前仔豬帶毒情況 第1天及第13天送檢樣品采用CSFV-RT-nPCR方法檢測,結(jié)果顯示第1天有3份樣品呈現(xiàn)豬瘟抗原陽性,第13天有32頭豬呈現(xiàn)豬瘟抗原陽性,第1天至第13天期間有5頭豬死亡,編號為26號、27號、29號、33號、36號,死亡豬檢測結(jié)果為豬瘟病毒陽性。

2.2 流行病學(xué)分析結(jié)果 將第1天及第13天樣品中CSFV-RT-nPCR檢測陽性樣本進行核苷酸序列分析,表明該批仔豬感染的CSFV屬于2.1亞群,與2.1亞群序列同源性為91.5%,與疫苗株同源性為81.0%。

2.3 豬瘟疫苗接種后抗原的檢測 采用CSFVRT-nPCR、CSFV-FQ-PCR和 HCLV-FQ-PCR三種方法分別對免疫后仔豬血樣進行檢測,檢測結(jié)果見表 1。其中 17號、23號、28號、30號、31號、34號 、37 號 、38 號 、39 號 、45號 、46 號 、47 號共 12 頭豬在免疫豬瘟疫苗后11 d期間陸續(xù)死亡,在表1中未列出,且12頭死亡豬3種檢測方法結(jié)果均為陽性。

表1 仔豬免疫后帶毒情況的檢測結(jié)果

從表1可以看出,在免疫接種初期,采用3種檢測方法均可在血液中檢測到豬瘟病毒的存在。而隨著免疫時間的延長,3種方法的檢測結(jié)果開始出現(xiàn)差異。HCLV-FQ-PCR在免疫后48 d,所有檢測結(jié)果均為陰性,由于HCLV-FQ-PCR只能特異性檢測豬瘟病毒疫苗株,說明在免疫48 d后,已經(jīng)檢測不出血液中的疫苗毒。CSFV-RT-nPCR和CSFVFQ-PCR不能夠鑒別豬瘟野毒和疫苗毒,因此,當感染動物體內(nèi)尚有未被中和的野毒時,二者的檢測結(jié)果仍可能為陽性。

表2 仔豬免疫后CSFV-RT-nPCR與CSFV-FQ-PCR陽性檢出數(shù)的比較

從表1及表2可以看出,隨著免疫時間的延長,陽性樣本的數(shù)量逐漸減少,CSFV-RT-nPCR檢測為陽性的樣本,CSFV-FQ-PCR的檢測結(jié)果也為陽性;且隨著免疫時間的延長,CSFV-FQ-PCR陽性樣本的檢出數(shù)高于CSFV-RT-nPCR,因此說明,CSFVFQ-PCR的敏感性高于CSFV-RT-nPCR。

另外,從表1中可以看出部分豬在免疫豬瘟疫苗后的不同時間內(nèi)出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。死亡豬的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),免疫豬瘟疫苗后48 d內(nèi)死亡的豬送檢樣品均可以檢測到豬瘟病毒,而免疫65 d后死亡的豬送檢樣品已經(jīng)檢測不到豬瘟病毒,通過向農(nóng)戶了解情況后得知,當?shù)卣诒┌l(fā)藍耳病疑似疫情,因此推測這些免疫豬瘟疫苗65 d后死亡的豬可能死于高致病性藍耳病。

3 討論

3.1 關(guān)于靈敏度 本試驗采用的CSFV-RT-nPCR方法[3]為歐盟豬瘟參考實驗室推薦的診斷方法,擴增區(qū)域為E2基因主要區(qū)域,具有較高的靈敏度,檢測極限可達5.3×10-1pg[6],國內(nèi)外一些實驗室也用此方法進行豬瘟流行病學(xué)分析[4-5,7]。熒光定量PCR方法是一種靈敏的快速檢測方法,與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、污染幾率小、自動化、高通量等優(yōu)點。本實驗室分別設(shè)計了檢測豬瘟病毒疫苗毒及野毒的通用探針(CSFV-FQ-PCR)和專門檢測豬瘟兔化弱毒疫苗的鑒別探針(HCLV-FQ-PCR),CSFV-FQ-PCR的靈敏度達到5.3×10-2pg(濃度為103.84TCID50mL-1豬瘟病毒石門株感染豬血液中的病毒提取總 RNA濃度),而HCLV-FQ-PCR的靈敏度可高達到8.18×10-5pg(濃度為體外轉(zhuǎn)錄的標準品RNA濃度)。

3.2 關(guān)于豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測 豬瘟兔化弱毒疫苗是世界公認的效果最好的豬瘟疫苗,包括中國在內(nèi)的很多國家都采用該株疫苗預(yù)防豬瘟[8]。因此,對豬瘟疫苗毒和野毒的鑒別診斷就顯得尤為重要。本實驗室建立的特異性的HCLV-FQ-PCR為解決這一難題提供了有效的方法。

3.3 關(guān)于免疫后的疫苗毒在體內(nèi)的存續(xù)時間 利用HCLV-FQ-PCR,對田間感染豬瘟病毒后緊急接種豬瘟疫苗的仔豬送檢樣品進行特異性檢測時發(fā)現(xiàn),免疫后仔豬血液中的疫苗毒存活時間可達48 d,因此提示我們,在采用分子生物學(xué)檢測方法進行豬瘟診斷時,應(yīng)對免疫豬瘟疫苗48 d前后的樣本進行綜合分析,以免豬瘟疫苗株對檢測結(jié)果造成影響。3.4 關(guān)于豬瘟病毒的持續(xù)感染 通過檢測結(jié)果可以看出,有11頭豬最終存活下來,但是仍然有3頭豬在88 d檢測時呈現(xiàn)CSFV陽性,在97 d檢測時仍有1頭豬呈現(xiàn)CSFV陽性,這說明,豬瘟病毒的持續(xù)感染現(xiàn)象是存在的。雖然感染豬并未死亡,但是可以持續(xù)性帶毒、散毒。如果這種持續(xù)感染豬不予以清除,必然成為豬瘟的持續(xù)傳染源。因此,對于規(guī)?；i場來說,定期進行豬群檢測,堅決淘汰病原陽性豬才是切斷豬瘟傳染源的關(guān)鍵。

[1]Paton D J,McGoldrick A,Greiser-Wilke I,et al.Genetic typing of classical swine fever virus[J].Veterinary Microbiology,2000,73(2-3):137-157.

[2]Lowings P,Ibata G,Needham J,et al.Classical swine fever virus diversity and evolution[J].Journal of General Virology,1996,77(Pt 6):1311-1321.

[3]Deng M C,Huang C C,Huang T S,et al.Phylogenetic analysis of classical swine fever virus isolated from T aiwan[J].Veterinary Microbiology,2005,106(3-4):187-193.

[4]Chen N,Hu H,Zhang Z,et al.Genetic diversity of the envelope glycoprotein E2 of classical swine fever virus:Recent isolates branched away from historical and vaccine strains[J].Veterinary Microbiology,2008,127(3-4):286-299.

[5]劉俊,王琴,范學(xué)政,等.豬瘟豬瘟病毒野毒株 TaqMan-MGB熒光定量PCR鑒別方法的建立與應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,42(12):4366-4371.

[6]T u C,Lu Z,Li H,et al.Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China[J].Virus Research,2001,81(1-2):29-37.

[7]仇華吉,童光志,沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗-半個世紀的回顧[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(8):1675-1685.