吳學(xué)軍，金鵬飛，朱峰，鄒定，胡欣，孫春華

(1.衛(wèi)生部北京醫(yī)院藥學(xué)部，100730;2.解放軍總參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處，北京 100017)

氨基葡萄糖屬于天然氨基單糖，可以刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生有正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，抑制損傷軟骨的酶(如膠原酶和磷脂酶A2等)，并可防止損傷細(xì)胞的超氧化自由基的產(chǎn)生，從而延緩骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程和疾病進(jìn)展，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)，緩解疼痛。鹽酸氨基葡萄糖膠囊是常見的氨基葡萄糖制劑，臨床上主要應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的治療和預(yù)防?，F(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-090)-2005Z采用Elson-Morgan反應(yīng)后的紫外分光光度法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，操作甚為復(fù)雜，且反應(yīng)程度受酸堿度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素的影響，結(jié)果不易控制。文獻(xiàn)對(duì)鹽酸氨基葡萄糖片劑含量測(cè)定方法的報(bào)道較多［1-3］，但對(duì)膠囊劑的報(bào)道甚少，有文獻(xiàn)［4-5］采用衍生化高效液相色譜法和衍生化氣相色譜法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，但操作也較為復(fù)雜。筆者在本實(shí)驗(yàn)中建立的高效液相色譜法可直接測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖膠囊的含量，具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Wasters 2695液相色譜分離系統(tǒng)(包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱)，Waters 2696二極管陣列檢測(cè)器和Empower?色譜工作站(美國(guó)，Waters公司);Mettler XP-205十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士，梅特勒公司);Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(法國(guó)，Millipore公司)。KQ-800KDE型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)，101A-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠)，SPX-250 IC微電腦人工氣候箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 試藥 乙腈(美國(guó)Fisher公司，色譜純)，磷酸二氫銨、磷酸、氨水、30%過氧化氫(分析純)。鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):649-200001)，鹽酸氨基葡萄糖膠囊(商品名:葡立?，山西中遠(yuǎn)威藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:每粒0.24 g，批號(hào):20100403，20100503，20100310)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:10 mmol·L-1磷酸二氫銨溶液-乙腈(95∶5，V/V);流速:0.5 mL·min-1;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):194 nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品約625 mg，置于50 mL量瓶中，加水適量，超聲使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，即為鹽酸氨基葡萄糖儲(chǔ)備液。精密量取鹽酸氨基葡萄糖儲(chǔ)備液適量，分別用水稀釋成濃度約為 1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg·mL-1鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液。以2.0 mg·mL-1的鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液為含量測(cè)定用對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取鹽酸氨基葡萄糖膠囊20粒，計(jì)算平均裝量，取內(nèi)容物研細(xì)，精密稱取內(nèi)容物粉末適量(相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖0.2 g)，置100 mL量瓶中，加水適量，超聲處理20 min，并用水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 根據(jù)鹽酸氨基葡萄糖膠囊的制劑配方，配制不含鹽酸氨基葡萄糖的陰性對(duì)照粉末。精密稱取陰性對(duì)照粉末適量(相當(dāng)于0.8粒輔料量)，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 基質(zhì)干擾實(shí)驗(yàn) 分別取陰性對(duì)照溶液、鹽酸氨基葡萄糖對(duì)照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示制劑輔料不干擾鹽酸氨基葡萄糖的測(cè)定，見圖1A-C。

2.5.2 強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn) 為進(jìn)一步考察方法的專屬性，對(duì)鹽酸氨基葡萄糖膠囊內(nèi)容物分別在加熱、光照、氧化、酸化和堿化等條件下進(jìn)行了強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)，以排除降解產(chǎn)物對(duì)鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的干擾。熱降解產(chǎn)物的考察:鹽酸氨基葡萄糖膠囊內(nèi)容物適量(相當(dāng)于鹽酸氨基葡萄糖0.2 g)，置于100 mL量瓶中，80℃烘箱加熱4 h，冷卻至室溫后，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。光降解產(chǎn)物的考察:上述內(nèi)容物置于微電腦人工氣候箱中，10 000 Lx光照強(qiáng)度下照射4 h后，制備供試品溶液;氧化產(chǎn)物的考察:在上述內(nèi)容物中加入30%過氧化氫溶液5 mL，暗處放置24 h后，制備供試品溶液;酸降解產(chǎn)物的考察:在上述內(nèi)容物中加入20%磷酸溶液5 mL，暗處放置24 h后，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液中和成中性，制備供試品溶液;堿降解產(chǎn)物的考察:在上述內(nèi)容物中加入1 mol·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，暗處放置24 h后，用20%磷酸溶液中和成中性，制備供試品溶液。強(qiáng)制降解試驗(yàn)表明:加熱、光照和酸性條件下，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的峰面積未見降低;氧化條件下，峰面積有所降低，但未檢測(cè)到雜質(zhì)峰;堿性條件下峰面積降低明顯，且能檢測(cè)到多個(gè)雜質(zhì)峰，但雜質(zhì)峰基本不干擾定量。見圖1D。

2.6 系統(tǒng)適應(yīng)性、最低檢測(cè)限和線性關(guān)系考察 取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，考察鹽酸氨基葡萄糖色譜峰的理論塔板數(shù)和對(duì)稱因子。其理論塔板數(shù)和對(duì)稱因子的平均值分別為7 077和1.33，RSD分別為1.80%和0.90%(n=6)。將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋后，以信噪比(S/N)約為3.0時(shí)的濃度為最低檢測(cè)限;鹽酸氨基葡萄糖的最低檢測(cè)限為0.04 mg·mL-1。以鹽酸氨基葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，在相當(dāng)于供試品溶液濃度50% ～150%的范圍內(nèi)進(jìn)行了線性考察，線性方程為:Y=1 652 666X+265 616，r為0.999 5。

圖1 4種溶液的高效液相色譜圖A.陰性對(duì)照溶液;B.對(duì)照品溶液;C.供試品溶液;D.供試品堿降解;1.鹽酸氨基葡萄糖

2.7 精密度和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 對(duì)批號(hào)為20100503的樣品獨(dú)立制備6份供試品溶液，測(cè)得鹽酸氨基葡萄糖含量的RSD為0.59%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。1份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰峰面積的RSD為1.40%(n=6)，表明儀器精密度良好。批號(hào)為20100503的樣品，由不同的操作者，連續(xù)6 d制備供試品溶液，測(cè)得鹽酸氨基葡萄糖含量的RSD為0.76%(n=6)，表明方法中間精密度良好。對(duì)保存于室溫中的供試品溶液(批號(hào)為20100503)分別于0，1，2，4，8 h 進(jìn)樣分析，測(cè)得峰面積的 RSD 為1.15%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 在陰性對(duì)照粉末中分別加入適量的儲(chǔ)備液，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在相當(dāng)于供試品溶液75%，100%和125%的濃度水平下，分別考察加樣回收率。每個(gè)濃度制備3份，峰面積平均值和對(duì)照品溶液峰面積平均值的比值作為回收率。測(cè)得3個(gè)濃度下的回收率分別為98.9%，100.9%和100.3%，RSD分別為0.81%，0.91%和0.60%(n=3)。

2.9 樣品測(cè)定 取批號(hào)為 20100403，20100503，20100310的鹽酸氨基葡萄糖膠囊樣品，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品制備3份，按上述色譜條件進(jìn)樣分析;按外標(biāo)法計(jì)算鹽酸氨基葡萄糖的含量。測(cè)得鹽酸氨基葡萄糖的平均含量分別為 100.0%，101.6%和98.8%，RSD分別為1.37%，1.90%和0.68%(n=3)。

2.10 方法學(xué)比較 為進(jìn)一步對(duì)方法學(xué)進(jìn)行驗(yàn)證，筆者還采用現(xiàn)行國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-090)-2005Z對(duì)批號(hào)為20100403，20100503，20100310的鹽酸氨基葡萄糖膠囊樣品進(jìn)行了測(cè)定，每批樣品制備3份，測(cè)得平均含量分別為101.3%，100.4%和98.7%，RSD分別為0.07%，0.17%和0.17%(n=3)。其測(cè)定結(jié)果和本法測(cè)定結(jié)果具有良好的一致性。

3 討論

目前，《美國(guó)藥典》雖未收載鹽酸氨基葡萄糖膠囊劑，但收載了原料藥和片劑，所用方法即為無(wú)需衍生化的高效液相色譜法，色譜柱:C8柱，流動(dòng)相:0.05%磷酸溶液(氫氧化鉀調(diào)至 pH 3.0)-乙腈(60∶40，V/V)，檢測(cè)波長(zhǎng):195 nm。但將《美國(guó)藥典》方法運(yùn)用于鹽酸氨基葡萄糖膠囊劑的測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)以下幾個(gè)問題:①鹽酸氨基葡萄糖色譜峰(tR=3.21 min)和堿降解產(chǎn)物的色譜峰幾乎完全重合，無(wú)法分辨;②峰形不佳，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰對(duì)稱因子＞1.5，理論塔板數(shù)＜2 500;③鹽酸氨基葡萄糖色譜峰和SO2-4、CO2-3、NO2-3色譜峰的分離度＜1.5。而本方法系統(tǒng)適應(yīng)性參數(shù)優(yōu)于《美國(guó)藥典》方法，鹽酸氨基葡萄糖色譜峰和SO2-4、CO2-3、NO2-3色譜峰的分離度均＞1.5，和堿降解產(chǎn)物色譜峰的分離度也達(dá)到1.3。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)磷酸二氫銨溶液的濃度和pH也進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加大濃度并不能改善分離度，反而會(huì)在鹽酸氨基葡萄糖色譜峰前面出現(xiàn)明顯的倒峰;降低pH會(huì)抑制色譜峰的強(qiáng)度，升高則峰形變差，反而是不調(diào)節(jié)最佳。

［1］ 洪專，黃宏南，許晨，等.HPLC-ELSD測(cè)定氨基葡萄糖含量［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17(6):1025-1026.

［2］ 任連杰，山廣志，李群，等.積分脈沖安培檢測(cè)-高效陰離子交換色譜法測(cè)定鹽酸氨基葡萄糖口腔崩解片含量［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2009，30(5):323-325.

［3］ 王英瑛，李俊，曾蘇.氨基葡萄糖3種含量測(cè)定方法的比較［J］.中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2009，26(4):307-309.

［4］ 李俊，王英瑛.衍生化氣相色譜法測(cè)定氨基葡萄糖制劑含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，28(3):359-361.

［5］ 王英瑛，李俊，曾蘇.反相高效液相色譜衍生化法測(cè)定氨基葡萄糖原料及其制劑的含量［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27(7):851-852.