朱中佳，熊富良，張雪瓊，高文天，馮井慶

(武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，430070)

甘草為豆科植物烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根及根莖，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急鎮(zhèn)痛、調(diào)和諸藥的功能［1］。甘草的主要成分為甘草酸等三萜皂苷和以甘草苷為主的甘草黃酮。中藥指紋圖譜是一種全面、定量反映中藥所包含的化學(xué)信息的分析方法，近年來中藥指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制的各個方面得到了廣泛的應(yīng)用，已成為國際公認(rèn)的控制中藥及植物藥質(zhì)量的有效手段［2］。筆者在本實驗中采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法建立了不同產(chǎn)地甘草藥材的指紋圖譜研究方法，為甘草的質(zhì)量控制研究提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEX P680型高效液相色譜儀，UVD 170U檢測器，Chromleteon 6工作站;JA2003N型分析天平，AS5150A型超聲波清洗器。

1.2 試藥 甲醇(色譜純)，磷酸(分析純)，水為高純水，甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110731-200615)。編號1～10的甘草藥材，分別購自內(nèi)蒙古呼和浩特、甘肅蘭州、河南焦作、新疆石河子、寧夏銀川、安徽黃山、浙江衢州、云南昆明、貴州貴陽、廣西桂林等地，均為1～3 a生的烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)和脹果甘草(Glycyrrhiza in flata Bat)的干燥根及根莖，由武漢理工大學(xué)化工學(xué)院劉小平教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil ODS2 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為甲醇-0.1% 磷酸水溶液，檢測波長254 nm，流速0.6 mL·min-1，進(jìn)樣量20 μL，柱溫25℃，檢測時間90 min。梯度洗脫條件見表1。

表1 甘草藥材梯度洗脫程序

2.2 供試品溶液的制備 將甘草藥材低溫烘干粉碎，精密稱取0.5 g置于錐形瓶中，加入67%甲醇約25 mL，室溫冷浸24 h后超聲提取30 min，定容至25 mL 后靜置，過孔徑0.45 μm 微孔濾膜即得［3］。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，用67%甲醇溶解并稀釋制成每毫升約含甘草酸0.2 mg的溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，測定各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果RSD均＜3%，說明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性實驗 取同一批藥材5份，按“2.2”項所述制備方法制備供試品溶液，記錄色譜圖，測定各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果RSD均＜3%，說明此測定方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，測定各共有峰的相對保留時間和峰面積，結(jié)果RSD均＜3%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立與分析

2.5.1 指紋圖譜的建立 分別精密吸取對照品溶液和10批供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄90 min色譜圖。

在各色譜峰中選取峰面積較大的10號峰，經(jīng)對照品對照確定其為甘草酸，作為參照峰。比較各批供試品的色譜圖發(fā)現(xiàn)，其中有11個峰為10批供試品所共有的，因此確定它們?yōu)楣灿蟹?，見圖1。計算10批供試品圖譜中各共有峰的相對保留時間及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果RSD值均＜3%，見表2。

圖1 甘草藥材指紋圖譜(5號供試品)

表2 10批甘草藥材共有峰相對保留時間

2.5.2 相似度計算結(jié)果 采用國家藥典委員會發(fā)行的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》分析10批甘草藥材指紋圖譜的相似度［4］，以批號為7的甘草藥材的指紋圖譜作為參照譜圖，以平均數(shù)法和中位數(shù)法分別計算10批藥材的相似度，其結(jié)果均＞0.9，見表3。

表3 甘草藥材指紋圖譜相似度計算結(jié)果

3 討論

筆者在本實驗中分別考察了甲醇-醋酸鹽緩沖溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液流動相系統(tǒng)，結(jié)果表明甲醇-磷酸水溶液系統(tǒng)的分離效果較好。同時采用紫外檢測器對指紋圖譜的檢測波長進(jìn)行選擇，以各主要成分峰的面積和分離度為指標(biāo)，最終確定以254 nm為檢測波長，在此波長下各色譜峰分離較好，基線較平穩(wěn)。

由相似度計算結(jié)果可知，10批甘草藥材除8號藥材外相似度均＞0.95，表明各地甘草藥材有較高的相似性;10批藥材的各共有峰面積存在較大差別，這表明各地藥材在主要成分的含量上有較大差異;而8號藥材相似度較低且其各共有峰的面積也明顯小于其他藥材，這可能與所購藥材質(zhì)量或當(dāng)?shù)厮幉牡募庸し绞接嘘P(guān)。

實驗結(jié)果證明選定的指紋圖譜研究方法可操作性強(qiáng)，重復(fù)性好，可作為甘草藥材指紋圖譜研究的基礎(chǔ)。

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:59-60.

［2］ 孫磊，喬善義，趙毅民.中藥指紋圖譜應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.國際藥學(xué)研究雜志，2009，36(3):194-197.

［3］ 段天璇，于密密，劉春生，等.HPLC法同時測定甘草指紋圖譜暨甘草苷、甘草酸含量［J］.中成藥，2006，28(2):161-165.

［4］ 樊天宇，王躍飛，過科家，等.內(nèi)蒙古產(chǎn)甘草藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(1):44-46.