廖亞玲，安薇，胡光煦

(湖北省中山醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430033)

連錢草為唇形科植物活血丹［Glechoma longituba(Nakai)Kupr.］的干燥地上部分，具有利濕通淋、清熱解毒、散瘀消腫等功能。近年來，有關(guān)連錢草的深入研究受到不少藥學(xué)工作者的青睞，相繼有學(xué)者對其所含的三萜酸類［1］、黃酮類［2-4］等化學(xué)成分進(jìn)行了分離提純，并建立了三萜酸類［5-7］(主要為齊墩果酸和熊果酸)及黃酮類［7-10］(主要為總黃酮、芹菜素和木犀草素)成分的定量分析方法，以此來更好地控制該藥材的質(zhì)量。但中藥提取物是多種活性成分的混合體，其藥效不是來自單一的活性成分，采用任何單一的活性成分或指標(biāo)都難以準(zhǔn)確地評判中藥的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，這種測定單一成分含量的方法并不能全面反映連錢草藥材的內(nèi)在質(zhì)量。

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)建立了連錢草的色譜指紋圖譜，并對不同產(chǎn)地連錢草的指紋圖譜進(jìn)行了比較分析，研究連錢草藥材之間差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SHIMADZU高效液相色譜儀(包括LC-20AT梯度二元泵，SPD-20A檢測器，日本島津)，金利超聲清洗器(上海杰里科技有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，SHZ-ⅲ型循環(huán)水真空泵和RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，METTLER TOLEDO 320 pH計(jì)(瑞士)。

1.2 試藥 芹菜素對照品(南京青澤科技醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司)，甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)，其余試劑均為分析純，水為超純水。連錢草藥材見表1。除去雜質(zhì)，自然晾干，粉碎，過內(nèi)徑0.425 mm(40目)篩，使用前60℃干燥4 h。

表1 連錢草藥材Tab．1 The resources of Herba Glechomae samples

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取芹菜素對照品適量，加甲醇溶解并稀釋，配制成1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備方法的選擇 采用四因素三水平正交設(shè)計(jì)，包括乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)和乙醇體積含量。以色譜主要峰面積(單峰面積＞1%)和各水平極差(R)為評價(jià)指標(biāo)，最終確定的連錢草提取方法為:稱取連錢草藥材2 g，用80%乙醇30 mL超聲提取30 min，共提取4次。

2.1.3 供試品溶液的制備 將連錢草藥材粉碎，過篩孔內(nèi)徑0.425 mm(40目)篩，60℃干燥4 h。精密稱取2 g，用80%乙醇超聲提取4次，每次30 mL，濾過，合并濾液，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑至干，用80%乙醇轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，定容，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過后備用。折合藥材濃度為80 mg·mL-1。

2.2 色譜條件

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化 由于中藥樣品成分復(fù)雜，色譜條件較難確定，筆者借助計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化軟件DryLab［液相資源公司(LC Resources INC.)的計(jì)算機(jī)模擬軟件，用于等度和梯度色譜條件預(yù)測］進(jìn)行優(yōu)化。以湖北恩施產(chǎn)連錢草提取液為優(yōu)化對象。流動(dòng)相選用(A)甲醇(0.5%醋酸，V/V)-(B)水(0.5%醋酸，V/V)，初始梯度洗脫程序?yàn)?A/B(5/95→95/5，V/V)，tG=45 min，最晚流出峰和最早流出峰的時(shí)間差△tR與梯度時(shí)間tG之比遠(yuǎn)大于0.4，適于梯度洗脫。儀器的系統(tǒng)滯留體積，(VD)約為3 mL。遵照DryLab軟件設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)優(yōu)化梯度速率和溫度的條件，流動(dòng)相梯度范圍為A/B(5/95→95/5)，溫度范圍為30～50℃，如圖1所示。

圖1 兩因素梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖Fig．1 The chematic diagram of two-factor gradient designs

2.2.2 色譜柱 Hypersil ODS2(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(0.5%醋酸，V/V):水(0.5%醋酸，V/V)，梯度洗脫;流速:1 mL·min-1;柱溫:40℃;檢測波長:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。梯度洗脫程序見表2。

3 結(jié)果

3.1 不同梯度時(shí)間和溫度下色譜峰的保留時(shí)間和峰面積 見表3。

表2 梯度洗脫程序Tab．2 The gradient elution program

將以上條件下得到的主要峰的保留時(shí)間和峰面積，以及滯留體積輸入DryLab中，經(jīng)過色譜峰校對后，得到梯度速率和溫度的兩因素分辨圖，見圖2。

如圖2所示，梯度時(shí)間從50 min延長到90 min，梯度變化速率從1.8%·min-1到1%·min-1(梯度范圍/梯度時(shí)間)均可增加分離度;而柱溫從30℃到50℃，分離度也得到改善。40℃以后，分辨率增加不明顯，為延長色譜柱使用壽命，最后確定柱溫為40℃。

表3 不同梯度時(shí)間和溫度下色譜峰的保留時(shí)間和峰面積Tab．3 Retention time and peak area of peaks for different gradient time and column temperature

圖2 溫度梯度時(shí)間兩因素分辨圖Fig．2 Resolution map of temperature and gradient time

在梯度洗脫過程中，除梯度速率對色譜行為有影響外，梯度范圍對于色譜峰在時(shí)間軸上的均勻分布及增加柱的峰容量也有顯著影響。由于DryLab以4個(gè)基本梯度為基礎(chǔ)已經(jīng)構(gòu)建出模型，對梯度的修改可以直接在軟件中進(jìn)行。最后確定以15 min為分界點(diǎn)，在DryLab中模擬結(jié)果如圖3所示。以上述條件實(shí)際進(jìn)樣分析所得色譜圖如圖4(A)所示。實(shí)驗(yàn)過程中，對梯度分界進(jìn)行了微調(diào)，即以12 min為分界點(diǎn)，前段梯度速率為2.8%，后期梯度速率降低至0.75%·min-1，得到圖4(B)，峰形滿足實(shí)驗(yàn)要求。采用分段檢測波長的方法，即前期(0→60 min)采用330 nm為檢測波長，后期(60→90 min)采用280 nm為檢測波長。

3.2 指紋圖譜的建立 連錢草樣品在上述色譜條件下，測得色譜圖可分為兩個(gè)區(qū)域:30 min之前的譜峰密集區(qū)和隨后的譜峰稀疏區(qū)。34 min附近均有一個(gè)中等強(qiáng)度峰(峰7)，經(jīng)在線紫外光譜和加入對照品溶液的方法證實(shí)為芹菜素，選擇它為參照峰(標(biāo)記為S)。在此基礎(chǔ)上求出所有色譜峰的相對保留值。

圖3 DryLab梯度程序模擬色譜圖Fig．3 The chromatogram simulated by DryLab

圖4 實(shí)際進(jìn)樣所得色譜圖(檢測波長330 nm)A.按DryLab模擬結(jié)果所得色譜圖;B.修改梯度分段點(diǎn)后的色譜圖Fig．4 The chromatogram of Glechoma longituba’s extraction in practiseA.Actual chromatogram according to the elution program simulated by DryLab;B.Actual chromatogram after changing segmenting point

在各產(chǎn)地連錢草的指紋圖譜中，比較10個(gè)不同產(chǎn)地連錢草指紋圖譜中各色譜峰的相對保留時(shí)間、峰面積、分離情況等，確定了13個(gè)共有峰，這些色譜指紋峰為連錢草樣品的100%共有峰，這13個(gè)色譜峰為連錢草的基本組成成分，可作為鑒別連錢草樣品的必要條件之一。

不同產(chǎn)地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積(共有峰與參照峰峰面積的比值)分別見表4，5。13個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的 RSD＜0.483%，但相對峰面積的 RSD＞57.04%，說明不同產(chǎn)地連錢草所含的共有化學(xué)成分的含量差異較大。

3.3 指紋圖譜的相似度評價(jià)和聚類分析 中藥色譜指紋圖譜的相似度評價(jià)是指紋圖譜用于中藥質(zhì)量評價(jià)和質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。筆者在本實(shí)驗(yàn)中以10個(gè)產(chǎn)地連錢草指紋圖譜中各共有峰的平均數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，采用夾角余弦作為相似度的評價(jià)指標(biāo)，以相對峰面積為參數(shù)，用SPSS軟件計(jì)算10個(gè)產(chǎn)地連錢草的指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度和樣品之間的相似度。結(jié)果產(chǎn)自湖北咸寧、湖北十堰、湖北恩施、湖北荊州1、湖北荊州2、湖北武漢、安徽六安、貴州安順、江蘇盱眙和對照藥材的相似度分別為 0.918，0978，0.961，0.933，0.905，0.945，0.970，0.949，0.910，0.942;上述各產(chǎn)地藥材與對照藥材之間的相似度分別為0.916，0.973，0.930，0.948，0.845，0.923，0.960，0.985，0.884。各產(chǎn)地連錢草藥材的相似度均＞0.9，反映了不同產(chǎn)地連錢草藥材的同源性。對各產(chǎn)地與對照藥材之間的相似度分析，除湖北荊州2和江蘇盱眙的相似度分別為0.845和0.884，其他產(chǎn)地均＞0.9。進(jìn)一步應(yīng)用SPSS軟件，采用組間關(guān)聯(lián)法(between-group linkage)，選用夾角余弦為測度，進(jìn)行聚類分析。10個(gè)產(chǎn)地的連錢草藥材可分為3類:湖北恩施、湖北武漢、湖北十堰、湖北荊州1和對照藥材為一類;安徽六安、貴州安順、湖北咸寧和江蘇盱眙為一類;湖北荊州2單為一類。從藥材來源上講，湖北荊州1和湖北荊州2均來自于同一地區(qū)，只是采集時(shí)間不同，且前者為種植，后者為野生，但兩者在三大分類中各占一類;從其共有峰的相對峰面積來看，峰2、峰8-13的相對峰面積均存在較大差異。其他各產(chǎn)地共有峰的相對峰面積也存在較大差異。這說明連錢草所含化學(xué)成分的含量可能與其生長環(huán)境、栽培方式、采收時(shí)間等有關(guān)。見圖5。

4 討論

中藥指紋圖譜反映了該中藥的化學(xué)組成及其含量分布狀況，可實(shí)現(xiàn)對中藥的多組分和多指標(biāo)分析。對鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣及其穩(wěn)定性均具有非常重要的參考價(jià)值。對中藥進(jìn)行色譜方法的開發(fā)是建立指紋圖譜的關(guān)鍵步驟，同時(shí)也是耗時(shí)最長、耗費(fèi)最大的一步。借助計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化軟件DryLab，筆者在本實(shí)驗(yàn)中對連錢草樣品進(jìn)行了提取方法、流動(dòng)相組成以及洗脫梯度程序，檢測波長等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，完成了系統(tǒng)的方法學(xué)考察，建立了連錢草高效液相色譜指紋圖譜，并對連錢草高效液相色譜圖譜的相似度進(jìn)行了評價(jià)。

采用夾角余弦為測度，聚類分析表明，10種不同產(chǎn)地、來源的連錢草可根據(jù)其指紋圖譜分成三大類，恩施，武漢，十堰，荊州1，對照品為一類，安徽，咸寧，貴州，咸寧，江蘇為一類，荊州2單為一類。10種湖北產(chǎn)地連錢草藥材有13個(gè)共有指紋峰，所含化學(xué)成分在組成上非常相似，但在含量方面仍存在一定差異，表明連錢草藥材的質(zhì)量與其生長環(huán)境密切相關(guān)，與采收時(shí)間和栽培方式也有一定關(guān)系。因此，運(yùn)用中藥指紋圖譜和指標(biāo)成分定量相結(jié)合的方式，既可以完善表述中藥的整體特征，

又有別于西藥單一成分定量的質(zhì)量控制模式。

表4 不同產(chǎn)地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對保留時(shí)間Tab．4 Relative retention time of common peaks of Glechoma longituba＇s extraction from different resources

表5 不同產(chǎn)地連錢草指紋圖譜中各共有峰的相對峰面積Tab．5 Relative peak areas of common peaks of Glechoma longituba＇s extraction from different resources

圖5 10個(gè)產(chǎn)地連錢草提取物的色譜圖(檢測波長:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm)Fig．6 Chromatograms of Glechoma longituba＇s extraction from ten different(Detection wavelength:0→60 min 330 nm，60→90 min 280 nm)

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