徐雪鈺，劉軍，于珊，劉青川，程麗娟，黃正明

(1.解放軍第309醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100091;2.解放軍第302醫(yī)院藥劑科，北京 100039)

靈五顆粒(lingwu granules，LW)由菌草靈芝和五味子等中藥配伍而成。該藥在臨床應(yīng)用多年，具有扶正活血、疏肝利膽、保肝等功效，主治急慢性乙型肝炎、肝炎后高膽紅素血癥等癥，療效明顯。為方便患者用藥，筆者采用了現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，將其精制成顆粒劑。此前實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LW對D-半乳糖胺致小鼠急性肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷具有明顯的保肝降酶作用［1］。由于該藥還具有治療肝炎后高膽紅素血癥等效果，筆者在本實(shí)驗(yàn)利用經(jīng)典 α-萘異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT)致小鼠黃疸性肝損傷模型觀察LW保肝退黃降酶的作用。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠，無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級，體質(zhì)量 18 ～22 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號:SCXK-(軍)-2007-004。

1.2 試藥 LW［解放軍第302醫(yī)院自制，批準(zhǔn)文號:總L(2001)第0001號，批號:091225，規(guī)格:每袋 10 g］，茵梔黃顆粒(魯南侯普制藥有限公司，批號:0909704)，均現(xiàn)用現(xiàn)配。ANIT(解放軍防化研究院第四研究所提供，批號:070512)，花生油(購自豐臺華堂商場)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，T-BiL)試劑盒(購于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號分別 為 110208005，100610001，20100325)，丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號分別為 20100421，20100421)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒(批號:20100831)等均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 85-2型恒溫磁力攪拌器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，722光柵分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠)，臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BS-120全自動生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，病理切片機(jī)、生物顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品)，F(xiàn)A2004分析天平(上海天平儀器廠)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥 健康昆明種小鼠108只(分3批，每批36只)，在解放軍第302醫(yī)院標(biāo)準(zhǔn)(Ⅱ級)動物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)并觀察2 d，然后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為6組，每組6只。正常組(0.9%氯化鈉溶液)，模型組，ANIT+茵梔黃顆粒組(10 g·kg-1，陽性對照組)LW高、中、低劑量組(ANIT+LW 10，5，2.5 g·kg-1)。各給藥組分別按0.02 mL·g-1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥7 d。正常組和模型組分別灌胃給予與LW高劑量等體積的0.9%氯化鈉溶液。末次給藥1 h后，除正常組外，其余各組均灌胃給予0.02 mL·g-1ANIT花生油105 mg·kg-1，制備小鼠黃疸型肝損傷模型。待中毒后繼續(xù)給藥1 d，中毒48 h后經(jīng)眼球取血并處死小鼠，取出肝臟，一部分做抗氧化指標(biāo)檢測，另一部分做肝病理學(xué)切片，鏡檢觀察。

2.2 觀察指標(biāo)與觀察方法

2.2.1 肝功能 眼球取血，將血液靜置 3 h，3 000 r·min-1離心 10 min(離心半徑:5 cm)，分離上層血清，全自動生化分析儀測血清ALT、AST活性及T-BiL含量。

2.2.2 肝組織氧化與抗氧化指標(biāo) 剪取肝組織右葉一塊，于冰鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱取0.2 g，放入玻璃勻漿管中，制成10%肝組織勻漿，測定肝勻漿中MDA含量和SOD活力。

2.2.3 組織病理學(xué) 從肝右葉剪一小塊組織，用10%甲醛溶液固定，固定好的肝組織由解放軍第302醫(yī)院病理科做組織切片，光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 LW對黃疸型肝損傷小鼠膽紅素及轉(zhuǎn)氨酶的影響3批實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，與正常組比較，模型組小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均明顯升高。LW中、高劑量組小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均顯著低于模型組，LW低劑量組T-BiL含量亦顯著降低。LW各劑量組間肝功改善結(jié)果具有良好的量效關(guān)系(表1)。陽性對照組小鼠血清T-BiL、ALT、AST含量均顯著低于模型組。

3.2 LW抗肝損傷組織氧化作用 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠肝臟MDA含量顯著增加，SOD活力和GSH含量顯著降低。與模型組比較，LW中、高劑量組肝組織MDA含量顯著降低，SOD活力顯著升高，見表1。

3.3 肝組織病理學(xué)改變 光鏡下，正常組肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈呈條索狀排列，整齊有序，大小一致，細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，匯管區(qū)肝膽管清晰可見(圖1A);模型組肝細(xì)胞酸性變性，匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞中度腫脹、壞死，管腔重度狹窄，大量炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)不清(圖1B);陽性對照組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，僅見個別肝細(xì)胞嗜酸性變，匯管區(qū)膽管上皮細(xì)胞輕度腫脹、無明顯壞死，另有輕度的炎性細(xì)胞浸潤(圖1C);LW高劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，清晰可見，未見肝細(xì)胞嗜酸性變，匯管區(qū)較清晰，膽管上皮細(xì)胞可見輕微腫脹，未見壞死，管區(qū)周圍有少量炎性細(xì)胞浸潤，中央靜脈及肝竇清晰(圖1D);LW中劑量組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞呈輕至中度變性，壞死，炎性反應(yīng)呈輕度變化，肝組織病變程度與陽性組相似(圖1E);LW低劑量組肝細(xì)胞可見嗜酸性變，匯管區(qū)炎性反應(yīng)較重，膽管上皮細(xì)胞可見明顯腫脹，輕度管腔狹窄(圖1F)。

表16 組小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH測定結(jié)果Tab．1 The serum levels of ALT，AST，T-BiL，MDA，SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

表16 組小鼠血清ALT、AST、T-BiL、MDA、SOD和GSH測定結(jié)果Tab．1 The serum levels of ALT，AST，T-BiL，MDA，SOD and GSH in 6 groups of mice ±s

ALT/(U·L-1)6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%AST/(U·L-1)第1批(n=6) 第2批(n=6) 第3批(n=6) 抑制率/%LW高劑量組 61.2±43.4*1 423.6±22.2*2 46.5±20.4*1 71.0 166.7±133.6*2 258.1±76.7*2 220.0±88.1*1 60.0中劑量組 111.6±57.3*2 144.4±42.1*2 51.4±18.5*1 57.0 231.2±89.6*2 430.0±130.9 168.3±28.5*1 49.0低劑量組 166.0±103.7*2 195.9±140.3 46.9±28.2*1 43.0 320.3±148.3 370.1±70.8 134.7±67.6*1 49.0 ANIT+茵梔黃顆粒組 169.5±36.2*1 72.2±52.8*2 115.5±59.6*1 50.0 353.3±72.6 180.0±103.6*2 312.1±157.1*1 48.0模型組 234.0±53.8 230.2±78.4 250.5±36.7 … 431.4±116.6 460.7±132.1 730.3±103.9 …正常組 7.9±1.0*1 7.8±0.3 7.1±1.4 … 33.2±3.8 30.9±4.7 33.5±4.9…

續(xù)表1 6組小鼠血清ALT、AST、T-BiL測定結(jié)果

4 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中采用ANIT造模后，血清 T-BiL、ALT、AST明顯升高，48 h達(dá)峰值，肝病理鏡檢結(jié)果證實(shí)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝內(nèi)膽管損傷嚴(yán)重，表明造模成功，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［2-7］。3批重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LW組小鼠血清T-BiL、ALT、AST水平均顯著低于模型組，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，結(jié)合肝病理變化較輕等，說明LW對造成的肝損傷具有較好的保護(hù)作用，退黃降酶效果明顯。與正常組比較，模型組肝臟SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高。這表明ANIT作為外源性過氧化物在肝臟轉(zhuǎn)化，經(jīng)氧化還原后在肝內(nèi)產(chǎn)生多種自由基，導(dǎo)致組織過氧化損傷。而LW各劑量組SOD活性升高，MDA含量降低，說明LW具有一定抗氧化、減少自由基產(chǎn)生、減輕肝組織過氧化損傷的作用。GSH是生物體內(nèi)重要的還原性物質(zhì)，可作為GSH等的輔酶而參與自由基的清除，同時，GSH也具有直接清除自由基的作用，與模型組比較，LW能升高GSH的含量，表明LW可能通過增加GSH的含量而清除自由基，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。肝組織病理學(xué)結(jié)果顯示，LW高、中劑量組與模型組比較，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、形態(tài)完整，肝細(xì)胞變性、壞死較輕，這表明 LW對肝臟可起到較好的保護(hù)作用。

圖1 6組肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果A.正常組;B.模型組;C.陽性對照組;D.LW低劑量組;E.LW中劑量組;F.LW高劑量組Fig．1 The histopathology of hepatic tissure of the 6 groupsA.normal group;B.model group;C.possitive control group;D.low-dose LW group;E.middle-dose LW group;F.high-dose LW group

總之，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LW可通過增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加速自由基清除，修復(fù)受損肝細(xì)胞，從而達(dá)到對ANIT所造成肝損傷的保護(hù)作用，使肝功能得到改善。

［1］ 徐雪鈺，于珊，胡克章，等.靈五顆粒對D-半乳糖胺鹽酸鹽致小鼠肝損傷的保護(hù)作用［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(5):426-427.

［2］ 方厚華.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物模型［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院出版社，2001:325.

［3］ 黃正明，楊新波，曹文斌，等.水芹退黃降酶療效的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥學(xué)雜志，1989，24(2):84-85.

［4］ JEAN P A，ROTH R A.Naphthylisothiocyanate disposition in bile and its relationship to liver glutathione and toxicity［J］.Biochem Pharmacol，1995，50(9):1469-1474.

［5］ DAHM L J，SCHULTZE A E，ROTH R A.An antibody to neutrophils attenuates alpha-naphthylisothiocyanate-induced liver injury［J］.J Pharmacol Exp Ther，1991，256:412-420.

［6］ 楊新波，黃正明，曹文斌，等.CCl4、D-Gal、ANIT 對化學(xué)性肝損傷小鼠血清生化指標(biāo)的影響［J］.世界華人消化雜志，1998，6(1):19.

［7］ 黃正明，楊新波，曹文斌，等.化學(xué)性及免疫性肝損傷模型的方法學(xué)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(1):42-46.