王剛，張秀華，楊金霞，常明泉，楊光義，葉方，段德鑒

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院1.藥學(xué)部;2.皮膚性病研究室，湖北十堰 442000)

人角質(zhì)形成細(xì)胞(human keratinocytes，HKC)在某些皮膚損傷疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，HKC成分不僅作為免疫佐劑參與疾病發(fā)生，而且分泌過量的趨化因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)疾病發(fā)生和維持疾病狀態(tài)［1］。已有研究表明，阿魏酸對中波紫外線(ultraviolet radiation B，UVB)所致 HKC 氧化損傷具有保護(hù)作用［2-3］，但阿魏酸對氯化鈷(CoCl2)誘導(dǎo)HKC氧化應(yīng)激形成炎癥損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制筆者尚未見報(bào)道。為此，筆者參照文獻(xiàn)［4］建立CoCl2誘導(dǎo)HKC氧化應(yīng)激和炎癥損傷體外模型，研究阿魏酸對HKC的保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 試藥 阿魏酸(湖北醫(yī)藥學(xué)院天然藥化教研室提供，批號(hào):20101026，純度:91.72%)，HKC(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院皮膚科饋贈(zèng))，CoCl2(Sigma公司)，HKC無血清培養(yǎng)基(keratinocyte serum free medium，K-SFM，Gibco公司)，達(dá)爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified minimal essential mediun，DMEM，Gibco 公司)，新生胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州四季清生物制品公司，批號(hào):100628)，人白細(xì)胞介素8酶聯(lián)免疫(interleukin-8 enzyme linked immunosorbent assay，IL-8 ELISA)試劑盒，人腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA 試劑盒(R＆D System)，96 孔培養(yǎng)板(Corning公司)。

1.2 儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，型號(hào):HH.B11)，倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠，型號(hào):XDS-1B)，超凈工作臺(tái)［力康(Heal Force)生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號(hào):HF safe-1200)］，熒光顯微鏡(日本BX-60F3奧林巴斯)，505型酶標(biāo)儀(奧地利safire多功能酶標(biāo)儀)，二氧化碳(CO2)孵箱(Thermo公司)，低溫高速離心機(jī)(德國賀利公司，Heraeus Germany)。

2 方法

2.1 藥物溶液的配制 取一定量阿魏酸濃縮液，用二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)充分溶解，加入無血清DMEM配成0.3 mg·mL-1藥物溶液(以所含阿魏酸質(zhì)量計(jì))，并使DMSO終濃度＜5%。56℃消毒30 min，紫外線照射12 h，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞的培養(yǎng) 用HKC無血清培養(yǎng)基10 mL和含10%FBS培養(yǎng)基將HKC混勻后移入40 mL培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，進(jìn)行傳代。選擇生長旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.3 藥物孵育 將上述培養(yǎng)獲得的HKC分成5組。Ⅰ組為正常對照組，在培養(yǎng)基上清液中加入0.9%氯化鈉溶液30 μL;Ⅱ組為CoCl2對照組:上清液中加入CoCl2(終濃度2 mmol·L-1);Ⅲ～Ⅴ組為阿魏酸高、中、低劑量+CoCl2組，在上清液中分別加入阿魏酸(終濃度 0.3，0.03，0.003 mg·mL-1)和 CoCl2(終濃度2 mmol·L-1)。培養(yǎng)基體積均為1 mL。

2.4 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽［3-(4， 5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］法檢測細(xì)胞生存率 HKC孵育24 h后，向每100 μL 培養(yǎng)基中加入5 mg·mL-1MTT 10 μL，孵育4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入5%DMSO 1 mL，室溫振蕩5 min，在490 nm波長處檢測各孔的吸光度值(A值)。

2.5 ELISA法檢測細(xì)胞因子 分別于藥物孵育24 h后收集細(xì)胞上清液，使用ELISA試劑盒，按照試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-8。

3 結(jié)果

3.1 阿魏酸對HKC生存率的影響 Ⅱ組HKC生存率為Ⅰ組的46.2%(P＜0.01);0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可呈劑量依賴性地提高HKC生存率，線性回歸方程為 Y=56.87X+133.06［X:阿魏酸濃度(mg·mL-1)，Y:細(xì)胞生存率］，r=0.96。見表 1。

3.2 TNF-α含量測定結(jié)果 與Ⅰ組比較，Ⅱ組TNF-α含量顯著增加(P＜0.01);與Ⅱ組比較，0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可抑制 HKC分泌 TNF-α(P＜0.05，P＜0.01)，0.003 mg·mL-1阿魏酸對 HKC 分泌TNF-α無明顯影響，見表1。

3.3 5組細(xì)胞IL-8測定結(jié)果 與Ⅰ組比較，Ⅱ組IL-8含量顯著增加(P＜0.01);與Ⅱ組比較，0.03和0.3 mg·mL-1阿魏酸可抑制HKC分泌IL-8(P＜0.05，P＜0.01)，0.003 mg·mL-1阿魏酸對 HKC 分泌 IL-6 和IL-8無明顯影響，見表1。

4 討論

CoCl2是一種常用的化學(xué)性低氧模擬劑，能誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生缺氧性損傷，導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低及細(xì)胞凋亡［5］。CoCl2還是一種有效的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。ERMOLLI等［6］報(bào)道，1～2 mmol·L-1CoCl2具有損傷HKC作用，能明顯降低HKC生存率，本研究結(jié)果與其研究結(jié)果吻合。此損傷作用可能與CoCl2增加活性氧生成、降低線粒體膜電位、促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)等氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

HKC在皮膚防御外界刺激的過程中參與機(jī)體的炎癥和免疫反應(yīng)，炎癥信號(hào)往往由HKC最先發(fā)出，HKC通過接受各種外界刺激，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的炎癥信號(hào)傳遞機(jī)制，表達(dá)和分泌重要的炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8 等［7］。由氧化應(yīng)激、炎癥損傷引起的皮膚損傷激活致炎細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞釋放大量促炎癥細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-8 等。

表1 5組細(xì)胞生存率、TNF-α與IL-8含量等測定結(jié)果Tab．1 Effects of ferulic acid on the survival rate，TNF-α and IL-8 of HKC in the 5 groups

IL-8作為作用強(qiáng)大的中性粒細(xì)胞趨化因子，其釋放的增加是導(dǎo)致皮膚中性粒細(xì)胞增多最主要的原因。紫外線輻射、氧化應(yīng)激、病毒等均可誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生。HKC能在較短的時(shí)間內(nèi)通過分泌IL-8促使中性粒細(xì)胞在皮膚局部聚集，誘導(dǎo)后續(xù)炎癥反應(yīng)。因此HKC在與皮膚損傷初始階段有關(guān)的炎癥反應(yīng)中起到重要的免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，CoCl2誘導(dǎo)HKC的IL-8分泌量與正常HKC比較有明顯差異。

本實(shí)驗(yàn)中，阿魏酸各劑量組HKC生存率均明顯高于CoCl2對照組，證實(shí)了阿魏酸可以減輕CoCl2對HKC的氧化損傷，有提高細(xì)胞生存率的作用。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以抑制CoCl2氧化損傷引起的TNF-α分泌，從而初步推測，阿魏酸通過抑制CoCl2炎癥損傷導(dǎo)致的TNF-α的分泌，保護(hù) HKC，提高細(xì)胞生存率，此外，阿魏酸能顯著抑制HKC分泌IL-8，該效應(yīng)在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性［8］。本實(shí)驗(yàn)中，阿魏酸通過影響HKC下游炎癥因子如TNF-α和IL-8分泌，從而參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，達(dá)到對HKC的保護(hù)作用，其具體信號(hào)調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究［9］。

［1］ NOWINSKI D，KOSKELA A，KIWANUKA E，et al.Inhibition of connective tissue growth factor/CCN2 expression in human dermal fibroblasts by interleukin-1alpha and beta［J］.J Cell Biochem，2010，110(5):1226-1233.

［2］ 劉淑穎，駱丹.阿魏酸對UVB導(dǎo)致HKC氧化損傷的保護(hù)作用研究［J］.中國美容醫(yī)學(xué)，2009，18(8):1102-1104.

［3］ 林秉獎(jiǎng)，閔瑋，駱丹.中波紫外線對HaCaT細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期變化及p16、c-myc蛋白表達(dá)的影響及阿魏酸干預(yù)作用研究［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2010，9(1):8-11.

［4］ 林春喜，張美芬，楊春濤，等.化學(xué)性低氧模擬劑氯化鈷誘導(dǎo)HKC炎癥反應(yīng)的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):633-637.

［5］ JUNG J Y，MO H C，YANG K H.Inhibition by epigallocatechin gallate of CoCl2-induced apoptosis in rat PC12 cells［J］.Life Sci，2007，80(15):1355-1363.

［6］ ERMOLLI M，MENNE C，POZZI G，et al.Nickel，cobalt and chromium-induced cytotoxicity and intracellular accumulation in human hacat keratinocytes［J］.Taxicology，2001，159(1-2):23-31.

［7］ KONDO S.The roles of cytokines in photoaging［J］.J Dermatol Sci，2000，23(11):30.

［8］ 劉心霞，辛建保，曹翠珍，等.阿魏酸鈉膠囊人體生物利用度與生物等效性研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29(5):600-603.

［9］ WALTER M N，WRIGHT K T，F(xiàn)ULLER H R，et al.Mesenchymal stem cell-conditioned medium accelerates skin wound healing:an in vitro study of fibroblast and keratinocyte scratch assays［J］.Exp Cell Res，2010，316(7):1271-1281.