趙文婧，魯 承，杜秋明 ，高 旭 ，高建偉，申峰勇，張 穎，袁 娜，房靖添

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，吉林延吉 133000）

鵝細(xì)小病毒病俗稱為小鵝瘟，是由鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus，GPV）引起的主要侵害4日齡～20日齡雛鵝和雛番鴨的一種烈性傳染病。由于該病病程短，傳播速度快，病死率高［1］，嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。GPV結(jié)構(gòu)多肽有3種，即VP1、VP2、VP3［2］，分子質(zhì)量分別為85、61、57.5ku，其中 VP3為主要結(jié)構(gòu)多肽［3］。研究發(fā)現(xiàn)VP3基因是鵝細(xì)小病毒核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80%，具有較高的保守性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是GPV主要保護(hù)性抗原［4－6］。雖然GPV最早是由我國學(xué)者分離獲得，但我國對GPV分子生物學(xué)方面的研究卻起步較晚［7］。本試驗制備了抗GPV VP3單克隆抗體，為研究快速、簡便、特異的鵝細(xì)小病毒病診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

GPV標(biāo)準(zhǔn)株來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，GPV延邊株、鵝副黏病毒（Goose paramyxovirus，GPMV）和鵝細(xì)小病毒VP3基因原核表達(dá)蛋白由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室提供，鼠抗GPV陽性血清為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室用標(biāo)準(zhǔn)株免疫制備；Balb／c小鼠購自吉林大學(xué)實驗動物中心；骨髓瘤細(xì)胞SP2／0為延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存；RPMI－1640培養(yǎng)液為Invirogen公司產(chǎn)品；聚乙二醇（MW 1450）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT培養(yǎng)基（hypoxantin aminopterin thymidin medium）、HT 培養(yǎng)基（hypoxantin thymidin medium）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG、單克隆抗體亞類鑒定試劑盒為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 鵝細(xì)小病毒VP3基因原核表達(dá)蛋白經(jīng)親和層析法進(jìn)行蛋白純化。取含10mg的融合蛋白溶液加入1mL已平衡好的500g／L的谷胱甘肽Sepharose 4B溶液中，室溫攪拌1h，500r／min離心5min，棄上清。用10倍于Sepharose 4B的PBS洗滌，500r／min離心5min，棄上清，重復(fù)2次。按照1∶1的比例加入還原性谷胱甘肽洗脫液（50 mmol／L Tris－HCl、10mmol／L 還 原 性 谷 胱 甘 肽，pH 8.0），室溫孵育10min，500r／min離心5min，吸取上清，重復(fù)2次。進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測蛋白純化情況。

1.2.2 動物免疫 按1∶1比例將抗原與弗氏完全佐劑乳化后，皮下多點注射6周齡～8周齡Balb／c小鼠（0.2mL／只）進(jìn)行初次免疫，分別在14d、21d將抗原與弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，進(jìn)行二免及三免。在取小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合的前3d尾靜脈加強(qiáng)免疫（50μg／只）。

1.2.3 融合用骨髓瘤細(xì)胞的制備 從液氮中取出凍存的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，加入5mL完全培養(yǎng)液，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞用于融合。

1.2.4 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備 取1只未免疫的Balb／c小鼠，眼球放血后小鼠脫頸處死。無菌剪開小鼠腹部皮膚，取10mL培養(yǎng)液注射到腹腔，輕揉小鼠腹部后，吸出腹腔液體。1 000r／min離心5min。加入培養(yǎng)液后，每孔100μL加入96孔培養(yǎng)板中，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

1.2.5 細(xì)胞融合及篩選 取免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按10∶1的比例在PEG 1450的作用進(jìn)行下融合，融合過程參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行，待融合細(xì)胞長到培養(yǎng)板的1／10時用間接ELISA方法［9］進(jìn)行篩選，選擇陽性孔用有限稀釋法進(jìn)行3次克隆，至所有孔呈陽性，制備單克隆細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.6 單克隆抗體亞類的鑒定 按單克隆抗體亞型鑒定試劑盒的操作說明，對待測樣品進(jìn)行檢測，測定單克隆抗體亞類。

1.2.7 腹水的制備及效價測定 每只Balb／c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0.5mL，1周后腹腔注射雜交瘤細(xì)1×106個／只，10d左右抽取腹部膨大的小鼠腹水，離心取上清，置－20℃保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA方法檢測腹水效價。

1.2.8 單克隆抗體特異性檢測 以GPV尿囊毒（延邊株、標(biāo)準(zhǔn)株）、GPV－VP3蛋白、陰性尿囊液、GPMV為抗原，與等體積的2×SDS－PAGE上樣緩沖液混勻，煮沸10min后，進(jìn)行SDS－PAGE分析，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，一抗為4E5雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 骨髓瘤細(xì)胞的制備結(jié)果

用完全培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)骨髓瘤細(xì)胞達(dá)到生長對數(shù)期時，細(xì)胞大小均一，細(xì)胞成透亮圓形，此時適于融合（圖1）。

2.2 抗原純化結(jié)果

表達(dá)蛋白經(jīng)親和層析純化后，進(jìn)行SDS－PAGE，GPV－VP3蛋白分子質(zhì)量大小為81ku，結(jié)果僅在81 ku處出現(xiàn)一條目的條帶。得到了純化的鵝細(xì)小病毒VP3基因原核表達(dá)蛋白（圖2）。

2.3 細(xì)胞融合結(jié)果

用間接ELISA方法篩選出3株能夠分泌抗GPV的單克隆抗體，采用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，最終篩選獲得1株能夠穩(wěn)定分泌抗GPV VP3的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為4E5。經(jīng)3次亞克隆后細(xì)胞仍呈透亮的近圓形（圖3）。

圖1 骨髓瘤細(xì)胞形態(tài)（10×40）Fig.1 Myeloma cell morphology（10×40）

圖2 GPV VP3純化蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of protein GPV VP3purified

圖3 3次亞克隆后雜交瘤細(xì)胞形態(tài)（10×40）Fig.3 Hybridoma cells after three subclones（10×40）

2.4 mAb亞型鑒定結(jié)果

按照mAb亞型鑒定試劑盒操作說明對4E5株mAb的亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明其為IgG1亞型，輕鏈為κ鏈。

2.5 腹水的效價檢測結(jié)果

以小鼠腹水為一抗進(jìn)行間接ELISA檢測抗體效價，結(jié)果表明4E5株的mAb腹水抗體水平可達(dá)到1∶25 600。

2.6 單克隆抗體特異性檢測

以4E5雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為一抗，進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，在81ku和85ku處出現(xiàn)特異性條帶，說明4E5能特異性識別GPV尿囊毒、GPV－VP3蛋白，與GPMV、陰性尿囊液無反應(yīng)（圖4）。

圖4 mAb的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of mAb

3 討論

單克隆抗體是由一個漿細(xì)胞分泌的、針對同一抗原決定簇的抗體，它具有高度特異性和敏感性，在蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究中發(fā)揮著重要作用［10］。單克隆抗體對疾病的診斷、治療也具有重要應(yīng)用價值。以往的鵝細(xì)小病毒單克隆抗體大都以鵝細(xì)小病毒為免疫抗原。但以病毒為抗原進(jìn)行免疫安全性較差，本試驗選擇鵝細(xì)小病毒VP3原核表達(dá)蛋白為抗原進(jìn)行小鼠免疫，因為鵝細(xì)小病毒VP3基因具有高度的保守性，具有較好的免疫原性［11］。本試驗所用VP3原核表達(dá)蛋白的融合表達(dá)蛋白載體為pGEX－4T－1。重組蛋白中含有GST，因此能與谷胱苷肽結(jié)合，故在抗原純化過程中應(yīng)用到的是谷胱苷肽Sepharose 4B。蛋白純化條件溫和，更好的保持了蛋白的天然構(gòu)象，有利于保持蛋白活性，提高免疫效果。細(xì)胞融合前對SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及篩選極為重要，將培養(yǎng)的SP2／0骨髓瘤細(xì)胞用8－AG進(jìn)行處理，防止細(xì)胞返祖，并加強(qiáng)了細(xì)胞對HAT的敏感性，利于融合。本試驗在融合劑的選擇上，選用了對細(xì)胞的毒性較小的PEG 1450，這更利于細(xì)胞融合后的生長。通過ELISA法檢測及有限稀釋法多次亞克隆，便能得到我們所需要的能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆融合細(xì)胞。

目前檢測鵝細(xì)小病毒的方法有中和試驗、免疫熒光試驗、瓊脂擴(kuò)散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗以及普通PCR等方法［12］，檢測方法較繁瑣，耗時長?？焖俚臋z測方法有待研制，如膠體金診斷試紙條，單克隆抗體的制備為該檢測方法研制奠定了基礎(chǔ)。

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