戚南山，孫銘飛，廖申權(quán)，吳彩艷，呂敏娜，袁建豐，余勁術(shù)，蔡建平，李祥瑞2

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，廣東廣州 510640；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095）

雞球蟲病是一種嚴(yán)重危害集約化養(yǎng)雞業(yè)生產(chǎn)、呈世界性流行的寄生蟲病，全球每年因雞球蟲病而引起的經(jīng)濟(jì)損失超過35億美元［1］。目前主要的防控手段仍是以活卵囊疫苗預(yù)防和抗球蟲藥物治療為主，目前雖然大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)雞體對(duì)球蟲的免疫主要以細(xì)胞免疫為主［2］，但對(duì)于蟲體與宿主細(xì)胞的詳細(xì)作用機(jī)理尚無系統(tǒng)認(rèn)識(shí)，所以新型有效疫苗的研制面臨巨大困難；而對(duì)于藥物方面，抗藥性蟲株的不斷出現(xiàn)及嚴(yán)重的藥物殘留問題都使得抗球蟲藥的使用受到限制，盡管青蒿素類的中藥［3］解決了化學(xué)藥物的殘留問題，但在臨床上也未得到廣泛應(yīng)用。所以目前篩選新型藥物靶標(biāo)及新一代疫苗候選分子都是防控雞球蟲病的重中之重。

棒狀體是頂復(fù)門原蟲所特有的一種分泌型亞細(xì)胞器。近年在弓形蟲及瘧原蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，蟲體在入侵宿主細(xì)胞時(shí)，棒狀體分泌的頸部蛋白（RON2、RON4、RON5）與微線分泌的頂膜抗原1（AMA1）共同作用形成“運(yùn)動(dòng)結(jié)合體（Moving Juction，MJ）”［4－5］，并與宿主細(xì)胞發(fā)生黏附作用，蟲體隨之進(jìn)入宿主細(xì)胞，然后形成納蟲空泡［6－8］。相關(guān)研究都證明棒狀體頸部蛋白和頂膜抗原一樣，對(duì)蟲體入侵宿主細(xì)胞起著關(guān)鍵作用，是這類寄生原蟲的毒力因子。

目前尚未見艾美耳球蟲棒狀體蛋白（EtROPs）和棒狀體頸部蛋白（EtRONs）功能、編碼基因研究的報(bào)道。隨著弓形蟲棒狀體頸部蛋白（TgRONs）和瘧原蟲棒狀體頸部蛋白（PfRONs）等功能和結(jié)構(gòu)研究的深入，以及多種頂復(fù)門原蟲基因組研究的全面展開，人們對(duì)RONs保守結(jié)構(gòu)域的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步深入，為從比較基因組和結(jié)構(gòu)信息學(xué)技術(shù)入手，利用比較基因組學(xué)原理預(yù)測(cè)艾美耳球蟲的RONs奠定了基礎(chǔ)。

本研究以TgRON2氨基酸序列對(duì)艾美耳球蟲數(shù)據(jù)庫進(jìn)行OminBlast分析，以 MacVector11.0為工具，對(duì)EtContig0031024進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)EtContig0031024中含有編碼TgRON2相似結(jié)構(gòu)的相關(guān)序列，預(yù)測(cè)分析拼接獲得EtRON2的編碼基因序列，進(jìn)行克?。徊⒁訣.tenellaDNA為模板，用PCR方法獲得基因組gDNA序列；利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的分析，為進(jìn)一步研究EtRON2的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物和飼料 1日齡嶺南黃肉雞，購自廣東省農(nóng)科院畜牧研究所種雞場(chǎng)；102全價(jià)肉仔雞飼料，不含任何抗球蟲藥和抗菌藥，廣東省農(nóng)科院畜牧研究所飼料廠特制。

1.1.2 菌株、載體和蟲株E.tenella（廣東株）卵囊，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所寄生生物學(xué)研究室分離并保存；E.coliDH5α為研究室所保存；質(zhì)粒載體pMD18－T easy為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 分子生物學(xué)試劑和試劑盒 IPTG、X－gal、SDS、PEG8000、DMSO、EDTA、Tris、DEPC、溴化乙淀、氨芐青霉素、溴酚蘭為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL2000為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖、RT－PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；EZNA質(zhì)粒小量制備試劑盒和DNA膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；TIANamp Genomic DNA Kit血液／細(xì)胞／組織基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Master Mix為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；LATaqTM為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；胰酶（trypsin）為Hyclone公司產(chǎn)品；?；撬崦撗跄懰徕c水合物（sodium taurodexycholate hydrate，TLC，minimum 97%）為Sigma公司產(chǎn)品；裂解液Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；氯仿，分析純，避光保存；異丙醇分析純；750mL／L乙醇溶液，用無核酶水依試驗(yàn)中所需的量現(xiàn)配制。PBS，TAE電泳緩沖液50×，參照文獻(xiàn)［9］配制。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基，LB瓊脂培養(yǎng)基，SOC液體培養(yǎng)基，配方參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行。

1.1.5 引物

（1）克隆EtRON2基因所需引物 根據(jù)預(yù)測(cè)的E.tenella棒狀體頸部蛋白EtRON2基因的cDNA序列用Premier Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，上海英駿生物工程公司合成：

上 游 引 物 RON2F：5′ － ATGATGCAACTAGAGTATCTCCCTG－3′；下游引物 RON2R：5′－TTATTTTGGCGACGCTTTTGG－3′。

（2）EtRON2基因組DNA序列的克隆引物（分4段擴(kuò)增） 上游引物 RON2ⅠF：5′－ATGATGCAACTAGAGTATCTCCCTG－3′；RON2ⅡF：5′－TGGCCTTCATTGCTCTTATCTCTTG－3′；RON2ⅢF：5′－TTGCCACGATGCTTACA －3′；RON2ⅣF：5′－CCTGCTGTACCGCTCACCT－3′。

下 游 引 物 RON2ⅠR：5′－TGTCCACCAAGAGATAAGAGCAATG－3′；RON2 Ⅱ R：5′ －GAAGAT － AACATTGTGGTTGGTGGTC －3′；RON2 ⅢR：5′－GCATGTTCACTTTGATACCT －3′；RON2ⅣR：5′－TTATTTTGGCGACGCTTTTGG－3′。

1.2 方法

1.2.1E.tenella子孢子的分離和純化方法 參照《雞球蟲病學(xué)》［1］。

1.2.2E.tenella子孢子總RNA的提取方法 參照Invitrogen公司的Trizol LS?Reagent試劑盒說明書。

1.2.3E.tenella子孢子基因組DNA的提取方法

參照Tiangen公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液／細(xì)胞／組織基因組DNA 提取試劑盒說明書。

1.2.4 RT－PCR 擴(kuò)增Etron2全長(zhǎng) ORF序列 以上述步驟抽提的E.tenella子孢子的總RNA作為模板，用TaKaRa公司的Prime Script TM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA；以cDNA為模板，RON2F，RON2R為引物，TaKaRa LATaqTM酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃30s，55℃30s，72℃ 4min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物純化回收后按試劑盒說明書連接至pMD18－T載體，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化子若干個(gè)，進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5Etron2ORF的基因組DNA擴(kuò)增 以上述步驟抽提的E.tenella子孢子DNA為模板，上述4對(duì)引物分四段擴(kuò)增Etron2ORF的基因組DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物與pMD18－T easy載體連接，并轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α克隆菌，經(jīng)PCR鑒定陽性菌送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.6 序列的分析 利用在線 Translate tool（http：／／www.expasy.ch／tools／dna.html）翻 譯EtRON2序列，對(duì)氨基酸序列用SignalP 3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）在線軟件進(jìn)行信號(hào)肽序列分析，利用TargetP 1.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）在線分析軟件對(duì)EtRON2進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；利用在線工具（http：／／myhits.isb－sib.ch／cgi－bin／motif＿scan）搜索保守的 motifs；利用在線工具 ClustalW 進(jìn)行多重序列比對(duì)分析（http：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW），將EtRON2氨基酸序列與其他頂復(fù)門原蟲RON2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 子孢子總RNA的提取

利用Trizol方法抽提的總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度為1μg／mL；電泳結(jié)果顯示分共為28S、18S和5S等3個(gè)大小不同的片段，條帶清晰（圖1）。

圖1 E.tenella子孢子總RNA電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis analysis of total RNA of E.tenellasporozoite

2.2 Etron2基因片段的RT－PCR結(jié)果

根據(jù)拼接的EtRON2序列，用設(shè)計(jì)的引物EtRON2F，EtRON2R 進(jìn)行 RT－PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果擴(kuò)增獲得一條約4 000bp的片段（圖2）。

2.3 轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定

將PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在Amp抗性平板上生長(zhǎng)的白色菌落為可疑重組子，挑單菌落培養(yǎng)，以菌液為模板，以引物EtRON2F，EtRON2R進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，獲得大小約為4 000bp（圖3）的條帶。

2.4 序列分析

克隆的Etron2ORF片段與pMD18－T載體連接后進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果表明序列全長(zhǎng)為4 020bp。利用在線工具ClustalW與預(yù)測(cè)的EtRON2部分序列進(jìn) 行 序 列 比 對(duì) 分 析 （http：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW），發(fā)現(xiàn)實(shí)際克隆結(jié)果較預(yù)測(cè)序列多出連續(xù)的162bp堿基，共編碼54個(gè)氨基酸，且未引入終止密碼子，說明不是因?yàn)間DNA污染所致的意外擴(kuò)增，并提示可能原參考Contig中可能漏失這段序列（圖4）。

圖2 Etron2基因全長(zhǎng)ORF的PCR擴(kuò)增鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of PCR products of full length ORF of Etron2gene

圖3 EtRON2的菌液PCR鑒定結(jié)果Fig.3 Identification of the positive clones of the EtRON2by PCR

圖4 克隆的EtRON2核苷酸序列與預(yù)測(cè)的EtRON2核苷酸序列的比對(duì)Fig.4 Alignment of cloned EtRON2of E.tenella Guangdong strain with predicted EtRON2coding sequence

2.5 Etron2ORF的基因組DNA擴(kuò)增

以E.tenella（廣東株）DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物分四段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增所得的片段Ⅰ約1 200 bp、片段Ⅱ約1 600bp、片段Ⅲ約1 800bp、片段Ⅳ約1 200bp（圖5）?？寺〉母鞫蜤tgDNA片段與pMD18－T載體連接轉(zhuǎn)化后進(jìn)行PCR鑒定（圖6），陽性菌進(jìn)行測(cè)序分析，拼接后得到Etron2ORF的5 197bp基因組DNA。利用在線工具ClustalW與已獲得的Etron2ORF序列進(jìn)行序列比對(duì)分析（ht－tp：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW），結(jié)果顯示EtRON2ORF的基因組序列具有大小不同的11個(gè)內(nèi)含子。

圖5 Etron2ORF基因組DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR Products of the Etron2ORF genome DNA

圖6 Etron2ORF基因組DNA的菌液PCR鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of the Etron2ORF genome DNA

2.6 EtRON2序列分析

2.6.1 信號(hào)肽 利用在線工具 SignalP 3.0 （http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號(hào)肽序列分析，結(jié)果顯示在EtRON2 1－39位是一個(gè)具有“Von Heijne”切割位點(diǎn)的疏水結(jié)構(gòu)域，具有典型的信號(hào)肽特征，信號(hào)肽切割位點(diǎn)應(yīng)為：VLL39－F40V之間。

2.6.2 細(xì)胞亞定位預(yù)測(cè) 利用TargetP 1.1server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TargetP／）在線分析軟件對(duì)EtRON2進(jìn)行細(xì)胞亞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示其為分泌蛋白；準(zhǔn)確系數(shù)為3（0.600＞diff＞0.400），較為準(zhǔn)確（圖7）。

2.6.3 跨膜結(jié)構(gòu)域分析 利用在線軟件（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM－2.0／）對(duì)EtRON2的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除去信號(hào)肽之外，該蛋白還有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖8）。

圖7 TargetP 1.1預(yù)測(cè)的EtRON2定位結(jié)果Fig.7 TargetP 1.1prediction results of EtRON2targeting peptide

圖8 EtRON2的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.8 Prediction of transmembrane helices in EtRON2

2.6.4 EtRON2與其他原蟲RON2氨基酸序列比對(duì) 利用在線多工具ClustalW（http：／／www.ebi.ac.uk／tools／clustalW）將 EtRON2 與 其 他 原 蟲RON2氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果顯示這些基因所編碼的氨基酸序列具有一定的相似性，各物種之間的相似性在15%～41%之間；構(gòu)建的分子進(jìn)化樹顯示，EtRON2與犬新孢子蟲的一未命名蛋白及TgRON2處于同一進(jìn)化枝上，進(jìn)化關(guān)系最為接近（圖9）。

3 討論

本研究對(duì)艾美耳球蟲基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在柔嫩艾美耳球蟲中存在TgRON2的同源蛋白EtRON2，利用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)得到EtRON2的開放閱讀框（ORF）全長(zhǎng)3 858bp，與Bromley等所報(bào)道的ropn2gene（GenBank：AM773998.1）相似。并以此為基礎(chǔ)成功克隆獲得EtRON2 4 020bp的全長(zhǎng)ORF基因序列，比預(yù)測(cè)序列多出162bp，推測(cè)可能在拼接該序列的時(shí)候遺失此段外顯子。在線NCBI比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與頂復(fù)門其他原蟲具有較高相似性。

經(jīng)過對(duì)擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行分析，EtRON2編碼1 339個(gè)氨基酸，具有39個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，理論分子量約148ku，等電點(diǎn)pI為8.873，說明編碼的EtRON2是一種堿性蛋白。與Toxoplasmagondii，Plasmodiumfalciparum，Theileriaparva，Babesiabovis的氨基酸序列進(jìn)行種系進(jìn)化分析可發(fā)現(xiàn)，EtRON2與TgRON2處于同一進(jìn)化樹上，進(jìn)化關(guān)系最為接近，而其在各物種之間的相似性在15%～41%之間，說明頂復(fù)門原蟲擁有保守的EtRON2序列，結(jié)合弓形蟲和瘧原蟲對(duì)該蛋白功能的研究［10－12］，也說明該蛋白在入侵過程中發(fā)揮重要作用。

在很多棒狀體蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，棒狀體蛋白首先合成為"前體蛋白"（pre－pro－proteins）的形式［13］。這種前體蛋白經(jīng)過信號(hào)肽的引導(dǎo)而進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工，然后進(jìn)入高爾基體包裝，最后由高爾基體分泌至棒狀體才成為成熟的蛋白質(zhì)。EtRON2也不例外，在進(jìn)行序列信號(hào)肽分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，EtRON2具有39個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，可以引導(dǎo)EtRON2的氨基酸序列進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工修飾，從而形成成熟的蛋白。

Besteiro S等［14］推測(cè)蟲體在接觸宿主細(xì)胞時(shí)，棒狀體迅速分泌頸部蛋白，并結(jié)合至宿主細(xì)胞膜上，然后，蟲體的微線分泌AMA1，并與結(jié)合在宿主細(xì)胞膜上的頸部蛋白特異性結(jié)合，完成蟲體與宿主細(xì)胞的黏附作用；在弓形蟲的研究中發(fā)現(xiàn)TgRON2的羧基端是連接AMA1和宿主細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白［15］。本研究發(fā)現(xiàn)EtRON2羧基端包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，將蛋白分成兩段膜外區(qū)，所以推測(cè)暴露在膜外的結(jié)構(gòu)即是與AMA1相互作用的位點(diǎn)。

綜上所述，本研究成功獲得柔嫩艾美耳球蟲棒狀體頸部蛋白EtRON2的基因序列，并進(jìn)行生物學(xué)分析初步了解該基因的特點(diǎn)，不僅填補(bǔ)了柔嫩艾美耳球蟲在此方面研究的空白，而且為進(jìn)一步研究其功能打下基礎(chǔ)。

圖9 不同物種RON2種系進(jìn)化分析Fig.9 Phylogenetic analysis of RON2s from different species

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