李鵬 周彤 凌楊

肺癌在我國是常見的惡性腫瘤[1]，除常規(guī)的手術(shù)、放療、化療和靶向治療外，應(yīng)用疫苗是肺癌非常有吸引力的治療策略之一。采用樹突狀細(xì)胞疫苗來免疫肺癌患者，在I/II期臨床試驗中已觀察到免疫反應(yīng)和腫瘤的緩解；而且不良反應(yīng)非常輕微。在先前的實(shí)驗中，我們以腺病毒為載體，將FL基因轉(zhuǎn)入DCs，初步證實(shí)轉(zhuǎn)基因DCs的成熟度、激發(fā)T細(xì)胞能力和分泌IL-12的水平均有較大的提高。本實(shí)驗應(yīng)用轉(zhuǎn)FL基因的DCs疫苗對小鼠Lwis肺癌皮下種植模型進(jìn)行治療，觀察可能存在的毒副反應(yīng)、臨床療效并尋找腺病毒載體轉(zhuǎn)染DCs疫苗的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 腺病毒載體試劑盒購自Stratagene公司；限制性核酸內(nèi)切酶購自Takara公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自Gibco公司；人重組GM-CSF、IL-4購自R&D公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大鼠抗小鼠細(xì)胞表面抗體CD11c(N418)、CD40(HM4023)、CD86(PO3)、Bcl2xl(H262)購自BDPharmingen公司；引物合成購自上海博亞生物技術(shù)公司，正義引物序列為:5’GGTACCATGACAGTGCTGGCGCCAGC，反義引物序列為：3’AAGCTTACGGGGCTGTCGGGGCTGTGG。

1.2 動物和細(xì)胞株 C57BL/6小鼠,雌性,6～8周齡,購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗動物研究所。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系L328細(xì)胞、黑色素瘤B16細(xì)胞由江蘇省人民醫(yī)院腫瘤中心提供。

1.3 Ad-FL表達(dá)載體及空載體Ad-c 由江蘇省人民醫(yī)院腫瘤中心提供。

1.4 DCs轉(zhuǎn)FL基因?qū)嶒?采用參考文獻(xiàn)[2]的方法體外分離、培養(yǎng)小鼠外周血單個核細(xì)胞，收集培養(yǎng)6d的DCs，吸去上清，按MOI為100加入病毒液，Lipofectamine 2000輔助轉(zhuǎn)染。再孵育2d，獲取轉(zhuǎn)基因DCs，分別在24h及48h收集上清液檢測IFN-γ濃度。48h后，收集并洗滌細(xì)胞，以每只5×106腹腔注射免疫小鼠。

1.5 T細(xì)胞增殖試驗 分離同基因小鼠T細(xì)胞，稀釋成3×106/ml,加入96孔培養(yǎng)板（100ul/孔），按DCs:T=1:50比例加入DCs，共分為4組。1組：攜帶AD-FL的293細(xì)胞組（AD-FL組）；2組：DCs-AD-FL組；3組：DCs組；4組：DCs-AD-c組。孵育72h后加入3H-TdR，繼續(xù)孵育12h。液體閃爍儀測量cpm值，按以下公式計算刺激指數(shù)（SI）：SI＝cpm/陰性cpm。

1.6 抗瘤實(shí)驗 實(shí)驗小鼠按每組10只，共4組：PBS對照組（PBS）、單純DCs組（DCs）、空載體修飾的DCs組（DCs-AD-c）、FL基因修飾的DCs組（DCs-AD-FL）。每周免疫1次，第2次免疫后1周，小鼠腋下接種Lewis肺癌細(xì)胞株（含細(xì)胞2×106），荷瘤1個月后，處死各組小鼠，稱取瘤重計算抑瘤率=(對照組腫瘤體積-治療組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。按照相同分組法觀察經(jīng)治小鼠的生存時間和一般狀況包括體重、體溫、毛發(fā)脫落情況及活動度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS15.0軟件進(jìn)行分析，計量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±sD)或百分率(%)表示，各樣本均數(shù)比較采用方差分析，生存時間利用秩和檢驗處理。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)FL基因?qū)Cs分泌IFN-γ的影響

共培養(yǎng)24h后，DCs組、DCs-AD-c組和DCs-ADFL組的上清液IFN-γ表達(dá)量分別為（50.0±2.5）pg/ml、（400.0±20.6）pg/ml、（800.0±88.5）pg/ml；共培養(yǎng)48h后，IFN-γ表達(dá)量分別為（100.0±8.5）pg/ml、（1100.0±123.5）pg/ml、（2000.0±154.3.5）pg/ml。DCs-AD-FL組上清液IFN-γ表達(dá)量明顯高于其他2組（P＜0.01）。

2.2 T細(xì)胞增殖試驗

DCs-AD-FL組和DCs-AD-c組SI值無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但均明顯高于其它各組（P＜0.01），見圖1。

1組：AD-FL組 2組：DCs-AD-FL組 3組：DCs組 4組：DCs-AD-c組

2.3 DCs疫苗的體內(nèi)抗瘤實(shí)驗

各實(shí)驗組經(jīng)兩兩組間比較，DCs-AD-FL組的平均瘤重明顯低于其它各組；DCs組及DCs-AD-c組的平均瘤重低于對照組；DCs-AD-FL組的抑瘤效果最好。經(jīng)多組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。同時，各組生存期也以DCs-ADFL組最長，明顯高于其它各組，各治療組的一般狀況包括體重、體溫、毛發(fā)脫落情況及活動度均好于對照組（P＜0.01），見表2。

表1 各組體內(nèi)抑瘤率

表2 各組生存期比較

3 討論

肺癌發(fā)病率在我國居高不下，雖然新的治療藥物和方法不斷涌現(xiàn)，但五年總體生存率僅在15%左右，其中起主要限制作用的是中晚期患者的生存率。未來的肺癌綜合治療應(yīng)該包括但不局限于手術(shù)、放療、化療和靶向治療。提高患者自身抗腫瘤能力，在不能完全去除腫瘤的情況下做到“與瘤共存”，對于改善中晚期患者的預(yù)后進(jìn)而提高總體生存率有重要意義。由專職抗原遞呈細(xì)胞為起點(diǎn)的細(xì)胞免疫是人體抗腫瘤的主要途徑，但在肺癌患者中程度不等的存在細(xì)胞免疫功能缺損，并且往往與肺癌的分期和預(yù)后[3]相關(guān)。因此以APC為切入點(diǎn)的免疫治療有廣闊的應(yīng)用前景。

研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可以通過多種途徑進(jìn)行免疫逃避，客觀上造成了DCs疫苗治療效果不盡如人意。解決辦法包括增強(qiáng)DCs疫苗抗腫瘤微環(huán)境免疫抑制的功能，促進(jìn)更多回輸?shù)腄Cs遷移至二級淋巴器官，選擇合適的腫瘤抗原負(fù)載DCs，以及轉(zhuǎn)入某些細(xì)胞因子基因以增強(qiáng)DCs激發(fā)靜息T細(xì)胞的能力。轉(zhuǎn)入細(xì)胞因子的DCs表現(xiàn)為更強(qiáng)的活性，更好的成熟度和遷移能力，是目前研究的熱點(diǎn)。Soares等[4]比較了MUC1多肽沖擊DCs與MUC1多肽直接免疫小鼠后在轉(zhuǎn)MUC1基因小鼠體內(nèi)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)前者可誘發(fā)更為強(qiáng)烈的抗腫瘤CD8-T細(xì)胞排斥反應(yīng)。較之以腫瘤細(xì)胞裂解物或抗原肽沖擊DCs制備疫苗，將編碼腫瘤抗原的cDNA轉(zhuǎn)入DCs，使之被持續(xù)致敏，則又前進(jìn)了一步。Chiappori等[5]使用p53轉(zhuǎn)導(dǎo)的DCs細(xì)胞免疫治療廣泛期SCLC的II期臨床研究；對于ED-SCLC接受常規(guī)化療后微小PD或更好療效的患者給以p53-DCs疫苗；每次用量2～5×106p53-DC，1次/2周，共3次；結(jié)果顯示：52.4%的病人獲得了特異性的針對p53的免疫反應(yīng)；27.7%的病人疾病穩(wěn)定；而PD的病人接受二線化療時,45%的病人有效，提示p53-DCs能夠增加腫瘤細(xì)胞對后續(xù)化療的敏感性，延長患者的生存期。

DCs基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步是選擇合適的載體。目前腺病毒是應(yīng)用最廣泛的載體系統(tǒng)。其優(yōu)點(diǎn)是[6]：（1)具有親肺的特性,可以轉(zhuǎn)化細(xì)胞周期各個階段的細(xì)胞,因此在肺內(nèi)轉(zhuǎn)化的效率較高；(2)病毒DNA不與宿主細(xì)胞DNA整合,因而較為安全；（3）可以容納近7.5kb的外源性DNA，具有較大的空間以攜帶目的基因；（4）腺病毒本身即具有一定刺激DCs成熟的能力。在我們先前的人體外實(shí)驗中，我們成功構(gòu)建重組腺病毒載體AD-FL，具有較高的滴度，在感染細(xì)胞后能穩(wěn)定且高水平表達(dá)可溶性FL蛋白。經(jīng)轉(zhuǎn)染的DCs有一定程度的活化趨勢。本實(shí)驗中，空載體轉(zhuǎn)染的（DCs-AD-c）具備分泌IFN-γ以及刺激T細(xì)胞活化的能力，在小鼠實(shí)驗中也有一定的抗腫瘤能力。與對照組以及DCs組相比，抑瘤率和生存期均有一定程度的提高。

增加DCs疫苗的效果的關(guān)鍵是導(dǎo)入合適的基因。人FL基因是一類早期造血細(xì)胞生長因子編碼基因。多種小鼠腫瘤模型[7]，如骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性Lewis肺癌、前列腺癌、子宮癌和卵巢癌[8]等，經(jīng)全身應(yīng)用FL蛋白可產(chǎn)生不同程度的抗腫瘤效果。促進(jìn)成熟DCs數(shù)量增加，恢復(fù)裸鼠的DCs表型缺陷和分布異常，提高分子表面MHCⅡ類分子的表達(dá)。在臨床接受FL治療的前列腺癌患者表現(xiàn)良好的耐受性，并發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞，包括DCs，NK細(xì)胞的增殖[9]。我們將表達(dá)FL可溶性蛋白的基因基因片段導(dǎo)入DCs，發(fā)現(xiàn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的DCs（DCs-AD-FL）刺激同基因小鼠T淋巴細(xì)胞增殖能力明顯高于其他2組，同時DCs-AD-FL組的平均瘤重明顯低于其它各組，生存時間也最長。

腫瘤細(xì)胞免疫功能缺損個體間存在差異，這是限制肺癌樹突狀細(xì)胞疫苗臨床效果的主要因素。我們初步研究了單個基因轉(zhuǎn)染疫苗的抗腫瘤作用，建立起穩(wěn)定的載體系統(tǒng)。有關(guān)用多基因以及針對個體有目的的選擇基因進(jìn)行治療，我們將進(jìn)一步的探索。

[1]孫燕.肺癌綜合治療進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2001,7（6）：52-58.

[2]Yang SC,Batra RK,Hillinger S, et al.Intrapulmonary Administration of CCL21 Gene-Modified Dendritic Cells Reduces Tumor Burden in Spontaneous Murine Bronchoalveolar Cell Carcinoma[J].Cancer Research,2006,66:3205-3213.

[3]Kurabayashi A, Furihata M, Matsumoto M, et al.Distribution of tumor-infiltrating dendritic cells in human non-small cell lung carcinoma in relation to apoptosis[J].Pathol Int,2004,54(5):302-310.

[4]Soares MM, Mehta V, Finn OJ.Three different vaccines based on the 140-amino acid MUC1 peptide with seven tandemly repeated tumorspecific epitopes elicit distinct immune effector mechanisms in wild-type versus MUC1-transgenic mice with different potential for tumor rejection[J].J Immunol,2001，166(11): 6555-6563.

[5]Antonia SJ, Mirza N, Fricke I, et al.Combination of p53 cancer vaccine with chemotherapy in patients with extensive stage small cell lung cancer[J].Clin Cancer Res,2006，12:878-887.

[6]Benihoud K, Yeh P, Perricaudet M.Adenovirus vectors for gene delivery[J].Curr Opin Biotechnol,1999,10(5):440-447.

[7]Fong CL, Mok CL, Hui KM.Intramuscular immunization with plasmid coexpressing tumour antigen and Flt-3L Results in potent tumour regression[J].Gene Ther,2005,15:245-256.

[8]Matsumura N, Mandai M, Hamanishi J, et, al.Immunostimulatory effect of Fms-like tyrosine kinase 3 ligand on peripheral monocytederived dendritic cells and natural killer cells: utilization for ovarian cancer treatment[J].Oncol Rep,2008,19(2):505-515.

[9]Higano CS, Vogelzang NJ, Sosman JA, et al.Safety and biological activity of repeated doses of recombinant human Flt3 ligand in patients with bone scan-negative hormone-refractory prostate cancer[J].Clinical Cancer Research,2004,10(4):1219-1225.