彭 昊，李 軍，謝宇舟，馬春霞，禤雄標(biāo)，胡 帥，楊 威，許力干，謝永平，陳澤祥，潘 艷

（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西南寧 530001）

副豬嗜血桿菌病又名豬革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為典型特征的傳染?。?］。本病呈世界性分布，在養(yǎng)豬發(fā)達(dá)國(guó)家都有此病的流行和發(fā)生，我國(guó)不少省市亦有該病報(bào)道［2－4］，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌等豬的呼吸道病原微生物混合或繼發(fā)感染，使豬的呼吸道傳染病更為復(fù)雜和嚴(yán)重，已成為重要的細(xì)菌性傳染病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害日益嚴(yán)重。由于副豬嗜血桿菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是病原分離和生化鑒定，按照KRG血清分型方法，目前副豬嗜血桿菌可分為15個(gè)血清型，但大約15%～41%的菌株無(wú)法進(jìn)行血清分型［5］，且血清分型尚有不同血清型常存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)、耗時(shí)、操作繁瑣等問(wèn)題，不利于流行病學(xué)規(guī)律的掌握，從而也阻礙了對(duì)該病的預(yù)防與治療。應(yīng)用分子生物學(xué)方法對(duì)副豬嗜血桿菌分型有助于克服傳統(tǒng)分類(lèi)方法的局限性。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者［6－13］利用 ERIC－PCR 技術(shù)獲取特異性的細(xì)菌DNA指紋圖譜來(lái)進(jìn)行基因分型，逐漸成為分型研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)廣西地區(qū)不同豬場(chǎng)分離的22株副豬嗜血桿菌進(jìn)行ERICPCR指紋圖譜分析，旨在為副豬嗜血桿菌分子流行病學(xué)研究提供一種實(shí)用性強(qiáng)、費(fèi)用低的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽(yáng)性血清 副豬嗜血桿菌1～15型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）為中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、新鮮特級(jí)馬血清為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；腸道菌科細(xì)菌微量生化鑒定管為杭州天和生化儀器公司產(chǎn)品；PCR Taq mix、DNA Marker 3為廣州東盛生物科技有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為北京天根生物公司產(chǎn)品。

1.1.3 供試菌株 供試菌株分離自廣西壯族自治區(qū)不同規(guī)?；i場(chǎng)臨診發(fā)生以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎為主要特征病變豬，具有“衛(wèi)星生長(zhǎng)現(xiàn)象”且不溶血、各種生化鑒定結(jié)果均符合副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株特征。

1.2 方法

1.2.1 供試菌株血清型鑒定 以副豬嗜血桿菌1～15型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)這22株細(xì)菌進(jìn)行血清型鑒定。

1.2.2 細(xì)菌DNA的提取 參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)［14］的方法，設(shè)計(jì)副豬嗜血桿菌ERIC－PCR引物。上游引物為：5＇－ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC－3＇，下 游 引 物為：5＇－AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG－3＇，由廣州invitrogen生物工程有限公司合成。

1.2.4 22株副豬嗜血桿菌的ERIC－PCR鑒定PCR反應(yīng)條件為95℃2min；94℃30s，50℃1 min，72℃2.5min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃10min。反應(yīng)結(jié)束后取20μL產(chǎn)物進(jìn)行20g／L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 ERIC－PCR指紋圖譜的聚類(lèi)分析 對(duì)副豬嗜血桿菌的ERIC－PCR多態(tài)性電泳圖譜進(jìn)行擴(kuò)增條帶的數(shù)量和大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，在SPSS軟件中，采用組間均聯(lián)法進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪出聚類(lèi)樹(shù)狀圖，以直觀了解各菌株的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 供試菌株血清型鑒定結(jié)果

對(duì)雙株供試菌用血清學(xué)方法進(jìn)行血清型鑒定，其中13株的血清型被確定，分別為血清2、4、5、9、10、11、13、14和15型，剩余9株供試菌株未被鑒定出血清型，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 副豬嗜血桿菌ERIC－PCR擴(kuò)增結(jié)果

22株副豬嗜血桿菌通過(guò)ERIC－PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜呈現(xiàn)出清晰可見(jiàn)的多態(tài)性條帶，大小范圍在200bp～2 500bp之間。重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)該方法具有良好的重復(fù)性。之前無(wú)法通過(guò)血清分型的菌株也得到充分分型 （圖1）。

表1 副豬嗜血桿菌的血清型及來(lái)源Table 1 Serum type of Haemophilus parasuis and distribution in different regions

圖1 22株副豬嗜血桿菌ERIC－PCR指紋圖譜Fig.1 ERIC－PCR fingerprints of 22 Haemophilus parasuis isolates

2.3 電泳圖譜的比較及數(shù)據(jù)分析

對(duì)每株副豬嗜血桿菌的ERIC－PCR多態(tài)性電泳圖譜進(jìn)行擴(kuò)增條帶的數(shù)量和大小統(tǒng)計(jì)后，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，在SPSS軟件中，采用組間均聯(lián)法進(jìn)行聚類(lèi)分析，繪出聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖（圖2）。由圖可看出，22株供試菌株可分為12種譜型，譜型相似的菌株各自聚為一類(lèi)，如其中第1號(hào)、第16號(hào)菌株ERIC－PCR圖譜帶型完全一致，聚為一類(lèi)。而第18號(hào)菌株與其余各株差異較大，在較遠(yuǎn)的分支上，提示該菌株與其他菌株相比遺傳背景差異較大，該病原與引起其他豬場(chǎng)發(fā)病的病原親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 22株副豬嗜血桿菌的ERIC－PCR聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster analysis by ERIC－PCR fingerprinting of 22 Haemophilus parasuis isolates

3 討論

Olvera A等［15］報(bào)道至少有15%～41% 的副豬嗜血桿菌不能用傳統(tǒng)的血清分型法進(jìn)行分型。本試驗(yàn)臨床分離的22株副豬嗜血桿菌中僅有13個(gè)血清型被檢出，未能分型菌株占總菌株數(shù)的40.91%。另外使用血清型分型方法需要具備15種標(biāo)準(zhǔn)血清，國(guó)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)室具有此條件的并不多。因此，用血清分型法對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行分型存在很大的局限性。而ERIC－PCR技術(shù)一般分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室均有條件進(jìn)行，操作步驟較簡(jiǎn)便，分型速度快。

副豬嗜血桿菌間存在很高的遺傳多樣性，不僅存在于同一個(gè)血清型的不同菌株之間，而且存在于大量的不可分型菌株之間。相對(duì)于血清學(xué)分型，ERIC－PCR技術(shù)對(duì)菌株的描述和比較的區(qū)分能力更高［16］。本研究未發(fā)現(xiàn)血清分型與基因分型之間有明顯的相關(guān)性，究其原因可能是因?yàn)檠宸中偷慕徊娣磻?yīng)未能消除，結(jié)果判定主要靠經(jīng)驗(yàn)，主觀性較大，因此試驗(yàn)數(shù)據(jù)的比對(duì)造成一定的影響。

ERIC－PCR為副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查提供了一個(gè)快捷的工具，有利于快速判斷出地區(qū)流行菌株及其傳播情況，從而為防控疫病傳播提供重要參考。從ERIC－PCR聚類(lèi)分析圖可見(jiàn)第10、11、13、22號(hào)菌株雖來(lái)自不同豬場(chǎng)，但帶型完全一樣，聚為一類(lèi)，提示流行于這幾個(gè)豬場(chǎng)的菌株親緣關(guān)系非常相近，很有可能是同一種菌株，類(lèi)似的還有第3、6、17號(hào)菌株等，疑似同種菌株。這為弄清副豬嗜血桿菌在地區(qū)間的傳播流行情況提供了直觀的信息，有助于了解豬場(chǎng)感染菌株的背景及傳染源的推測(cè)和追溯，說(shuō)明ERIC－PCR技術(shù)可以為副豬嗜血桿菌病的防控工作提供重要的輔助作用。

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