胡 薇 孟星宇 田玉華 劉 寧

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，長春，130118)

鹿茸角作為一種哺乳動(dòng)物器官，它具有兩個(gè)獨(dú)特的生長特性，即可再生和快速生長。而鹿茸生長發(fā)育機(jī)制的研究使它成為一個(gè)極其重要的哺乳動(dòng)物骨質(zhì)器官再生的自然模型［1－2］。鹿茸角生長速度之快是其它哺乳動(dòng)物組織和器官無法相比的，其生長最旺盛階段每天可長1～2 cm［3］。因此，人們推測其中可能存在特殊的促進(jìn)骨和上皮組織快速生長的活性物質(zhì)，促進(jìn)骨質(zhì)和表皮層的增殖。胰島素樣生長因子受體(insulin－like growth factor receptor，IGFR)在動(dòng)物體的生長發(fā)育過程中起著舉足輕重的作用。胰島素樣生長因子受體有兩種，分別稱為IGF1受體和IGF2受體。IGF2受體沒有IGF的信號傳導(dǎo)功能，可能僅僅是一種清除型受體，其功能在于獲取和降解IGF2。IGF對細(xì)胞的作用絕大多數(shù)都是通過與IGF1受體結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。而IGF1是一種重要的強(qiáng)有絲分裂原，主要通過IGFR1受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而且兩者必須結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)作用。大量的研究已證明［4］，鹿茸的生長中心位于頂端，該處組織是生長因子和其它很多生理活性成分含量高的部位。馮海華等［5］報(bào)道IGF1是一種促細(xì)胞分化的生長因子，存在于鹿茸角頂部增殖區(qū)，能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞及軟骨細(xì)胞的增殖。而Suttie［6］早前曾發(fā)現(xiàn)，在鹿茸頂部非骨化部位存在大量受體IGF1R，可促進(jìn)鹿茸細(xì)胞的增殖。近些年的許多研究結(jié)果也證明了一些生長因子存在于鹿茸頂部，IGF1和IGF1R可能是影響鹿茸生長速度的主要因素之一。目前，對鹿源IGF1R的研究相對較少，而許多其它動(dòng)物的IGF1R基因及氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中都相繼被登出。但是，未見有關(guān)梅花鹿IGF1R基因方面的相關(guān)報(bào)道。鑒于IGF1R在動(dòng)物生長軸上的重要作用，本研究將通過IGF1R基因的部分cDNA克隆及在鹿茸頂端不同部位組織的差異表達(dá)分析，揭示鹿茸快速生長階段IGF1R對其生長的調(diào)節(jié)作用和規(guī)律，為探索鹿茸再生的機(jī)理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮東北梅花鹿鹿茸于2010年6月上旬采自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)鹿場1頭3歲齡左右的健康雄鹿，保存于液氮中立即帶回實(shí)驗(yàn)室備用。TRIzoL試劑購自Invitrogen公司，pMD－18T vector、Ex Taq DNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、限制性內(nèi)切酶 XbaⅠ和 PstⅠ、dNTP、DL －2000 Marker購自 TaKaRa公司，Real Master Mix購自長春寶泰克公司。

1.2 樣品制備

鹿茸組織區(qū)別于其他組織和器官的重要一點(diǎn)是生長中心位于頂端，因此，鹿茸的頂端是生長最旺盛的部位。根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和生長特點(diǎn)，可將鹿茸頂端組織大致分為真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層。使用一次性手術(shù)刀在離鹿茸頂端生長點(diǎn)5 cm處垂直鹿茸生長軸方向切斷，切取真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織各100 mg，于液氮保存。

1.3 鹿茸頂端組織總RNA提取及RT－PCR反應(yīng)

按照Trizol操作手冊分別提取真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織各樣品總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光法檢測總RNA質(zhì)量和含量。以總RNA為模板，以O(shè)ligo－dT為引物(工作濃度為10 μmol/L)，以逆轉(zhuǎn)錄酶AMV反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.4 IGF1R基因克隆及序列分析

參照GenBank中相關(guān)序列，設(shè)計(jì)IGF1R基因特異性引物(IGF1R上游引物:AAGGAATGAAGTCTG GCTCCG和下游引物:AGGAAGGACAAGGAGACCAAGG)，以軟骨組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，并克隆入pMD18－T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆制備質(zhì)粒，并將鑒定正確的重組質(zhì)粒送TaKaRa公司測序。將梅花鹿IGF1R基因與牛(XM_002696504)、豬(NM_214172)、人(BC143721)、小鼠(BC138869)等物種IGF1R基因CDS區(qū)DNA及氨基酸序列利用Blast分別進(jìn)行比對分析。

1.5 Real－time PCR法檢測IGF1R基因在鹿茸頂端不同部位組織的表達(dá)水平

合成IGF1R基因特異引物(上游引物5'－GCACCATCTTCAAAGGCAATC－3'和下游引物5'－GAGACCAAGGCGTGGGAGT－3')，擴(kuò)增片段長度為136 bp。以鹿的持家基因actin(GenBank登錄號:AY345228)作為內(nèi)參基因，合成actin引物(上游引物5'－TGACCCTTAAGTACCCCATCGA－3'和下游引物5'－TTGTAGAA GGTGTGGTGCCAGAT－3')，擴(kuò)增片段長度為85 bp。采用Real Master Mix試劑和7500 Real Time PCR System分析IGF1R基因在真皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。Real－time PCR體系:1 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的 cDNA，上下游引物各5 pmol，10 μL real Master Mix，總體積為25 μL。反應(yīng)條件:94℃激活 DNA聚合酶2 min，94 ℃變性20 s，60 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸45 s;進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。隨后做PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線分析，使用StepOne Software v2.1軟件分析IGF1R相對內(nèi)參actin基因的差異表達(dá)Ct值(Ct為熒光達(dá)到熒光閾值的循環(huán)數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹿茸頂端組織總RNA的提取

各樣品總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可清晰見到28 S、18 S和15 S rRNA各1條帶(圖1)，表明本試驗(yàn)所提取的鹿茸真皮、間充質(zhì)、前軟骨和軟骨組織總RNA是基本完整的，材料保存和提取過程未發(fā)生RNA降解。

2.2 IGF1R基因的克隆

IGF1R基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳得到1 203 bp左右的1條特異性條帶(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符。提取質(zhì)粒，分別用XbaI、PstI雙酶切和PCR鑒定重組質(zhì)粒pMD－18T－ IGF1R(圖3)，從圖3中可看出，均得到了與目的帶大小相符的明顯的電泳帶，表明克隆基本成功。

2.3 IGF1R基因的序列分析

東北梅花鹿IGF1R基因與其它4個(gè)物種的DNA和氨基酸序列比對結(jié)果分別見圖4和圖5。其中:梅花鹿IGF1R基因編碼區(qū)部分序列為1203 bp，與牛、豬、人和小鼠核酸序列同源性分別為 98.07%、94.21%、93.94%、88.05%(圖 4);IGF1R蛋白氨基酸序列長度為401個(gè)氨基酸，與牛、豬、人和小鼠同源性分別為 98.3%、98.5%、97.8%和 94.5%(圖 5)。

圖1 鹿茸頂端組織總RNA提取結(jié)果

圖2 IGF1R基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD－18T－IGF1R的PCR和雙酶切鑒定結(jié)果

2.4 IGF1R基因在鹿茸頂端不同部位組織的差異表達(dá)

相對熒光定量PCR結(jié)果顯示:以梅花鹿actin作為內(nèi)源參照基因，在鹿茸頂端間充質(zhì)、真皮、前軟骨和軟骨組織中，IGF1R基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平存在著明顯的差異。其中:在軟骨區(qū)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平高于其它部位;其次，由高到低為前軟骨層、真皮層和間充質(zhì)層。見圖6、表1。

圖4 東北梅花鹿、牛、豬、人及小鼠IGF1R基因DNA序列分析

圖5 東北梅花鹿、牛、豬、人及小鼠IGF1R氨基酸序列分析

圖6 鹿茸頂端不同部位組織IGF1R基因的PCR擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)為Cycle;縱坐標(biāo)為ΔRn。

表1 相對熒光定量PCR法檢測鹿茸頂端組織IGF1R基因的表達(dá)水平(n=3)

3 討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼在鹿茸中發(fā)現(xiàn)了各種細(xì)胞生長因子，如胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子，表明鹿茸是一個(gè)天然的細(xì)胞生長因子庫［7－8］。最近研究表明，鹿茸生長因子不但與鹿茸生長有關(guān)，還與鹿角柄的形成及鹿茸的轉(zhuǎn)化有關(guān)［9］。已知IGF1R為糖蛋白，是一種細(xì)胞生長因子受體，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞的表面，它接受IGF1和IGF2的刺激發(fā)揮促細(xì)胞生長、分裂及分化等生理作用［10］，介導(dǎo)IGF1和大部分IGF2的生物活性，維持細(xì)胞的最佳生長條件和促進(jìn)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。Elliott［11］曾報(bào)道鹿茸頂端存在IGF－1受體，并推測IGF－1R在鹿茸頂部以內(nèi)分泌的方式發(fā)揮其作用。而IGF－1是一類多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，通過與IGF1R受體結(jié)合而發(fā)揮作用，對胚胎發(fā)育和多種細(xì)胞的生長增殖都在不同程度上發(fā)揮了積極的生物學(xué)功能［12］。因此，IGF1R基因?qū)?dòng)物體的生長發(fā)育具有重要的作用。

目前，鹿的IGF1R基因研究甚少，且cDNA尚未得到克隆，GenBank中關(guān)于梅花鹿IGF1R基因序列沒有任何記錄。本研究根據(jù)牛和豬的IGF1R基因序列設(shè)計(jì)引物，通過RTPCR和PCR技術(shù)克隆了梅花鹿IGF1R基因cDNA的部分序列，并與牛、豬、人和鼠4個(gè)物種IGF1R基因進(jìn)行了核苷酸和氨基酸序列的比較分析，結(jié)果表明:該序列與牛、豬的IGF1R基因序列高度同源。

RT－PCR是一種非常敏感的檢測方法，但無論競爭RT－PCR還是內(nèi)源性參比基因RT－PCR定量法，它們均屬PCR終點(diǎn)檢測法，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期和平臺期產(chǎn)量相差極大，很難對起始模板數(shù)準(zhǔn)確定量。熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好和定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，成為基因工程研究中的重要工具，目前已得到廣泛應(yīng)用［13］。本研究利用Real time PCR方法，以梅花鹿actin基因作為內(nèi)源參照基因，對梅花鹿IGF1R基因的4種組織進(jìn)行了組織相對定量表達(dá)分析，結(jié)果表明:IGF1R基因在檢測的所有組織中均有不同程度的表達(dá)，該結(jié)果具有很好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，且檢測結(jié)果用拷貝數(shù)來表示起始模板的含量，相對半定量RT－PCR中的比較值更為準(zhǔn)確可靠。通過數(shù)據(jù)分析顯示:IGF1R基因在軟骨組織中表達(dá)量最高;其次，由高到低依次為前軟骨層、真皮層和間充質(zhì)層。試驗(yàn)結(jié)果初步表明，IGF1R是鹿茸再生過程中軟骨生長的主要調(diào)節(jié)因子之一。

目前，國內(nèi)外對IGF1R基因的研究主要集中在其與腫瘤的關(guān)系上［14－15］，提示IGF1R和IGF1以自分泌途徑參與腫瘤發(fā)病過程，由于兩者活性增強(qiáng)，促使受體活化水平的提高和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的異常增殖;而鹿茸細(xì)胞的增殖速度比腫瘤細(xì)胞快30倍。IGF1R基因到底在鹿茸組織中發(fā)揮著怎樣的功能，還需要今后大量的試驗(yàn)研究去證實(shí)。近幾年，筆者在尋找參與鹿茸再生調(diào)控的關(guān)鍵因子方面取得了一定的進(jìn)展，但是對于鹿茸復(fù)雜的生長調(diào)控機(jī)制研究而言，仍然處于初級階段。本研究只是針對IGF1R基因在東北梅花鹿這個(gè)物種上進(jìn)行了初步的探索，為進(jìn)一步研究IGF1R在鹿茸角快速生長和再生過程中可能具有的重要作用，提供一定參考和可利用的基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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