張志敏 張穎穎 謝寅峰 楊萬霞 尚旭嵐 方升佐

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

青錢柳(Cyclocarya paliurus(Bata.l)Ijinskaja)，系胡桃科青錢柳屬植物［1］，又名青前李(江西)、山麻柳(四川)、甜茶樹(貴州)、一串錢(湖北)等，是我國獨有的單種屬植物，也是國家重點保護的瀕危植物之一。青錢柳種子具有深休眠習性，自然生長的青錢柳不僅數(shù)量少，且多零星分布于深山老林，自然更新率低，人工栽培青錢柳的成活率也不高［2］，嚴重影響了青錢柳的開發(fā)利用與產(chǎn)業(yè)化進程。植物的各種器官及組織經(jīng)培養(yǎng)均可產(chǎn)生愈傷組織，并能不斷繼代繁殖。愈傷組織可以作為研究植物脫分化和再分化、生長和發(fā)育、遺傳和變異、育種及次生代謝物生產(chǎn)的理想材料，此外，還是懸浮培養(yǎng)的細胞、原生質(zhì)體的來源［3］。文中以青錢柳3年生幼樹上嫩莖和葉片作為外植體，研究不同消毒劑配方、不同培養(yǎng)基種類及不同質(zhì)量濃度的生長調(diào)節(jié)劑對青錢柳愈傷組織的影響，篩選出獲得大量愈傷組織的最優(yōu)方案，為進一步建立青錢柳組培快繁及懸浮培養(yǎng)體系提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

采自江蘇鎮(zhèn)江南京林業(yè)大學教育基地。取3年生青錢柳幼樹當年生的嫩枝作為外植體，采后立即進行冰盒保鮮，在2 h內(nèi)帶回實驗室進行材料的預處理。以嫩葉和莖段作為誘導愈傷組織的材料。

外植體預處理與消毒:取青錢柳幼樹上當年生枝條上的嫩葉，嫩枝剪成1.5～2 cm長的莖段，分別先用流水沖去表面的臟物，體積分數(shù)為1%的洗潔精溶液浸泡3 min，再用軟刷輕輕刷洗外植體表面，除去附著在莖、葉表面上的塵土和部分菌體，在流水中沖洗1～2 h。瀝水后，浸在蒸餾水中待用。預處理后的材料在超凈工作臺上進行消毒處理。各處理后均用無菌水沖洗5～8次。然后在超凈工作臺上將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的方塊，莖段剪成0.5～1 cm的長條接種到預先配好的培養(yǎng)基中，進行愈傷組織的誘導。葉片每個處理接10瓶，莖段每個處理接種7～9瓶，各處理均重復3次。消毒處理方法見表1。接種后定期觀察，隨時取出污染的培養(yǎng)瓶，并記錄污染數(shù)。30 d后統(tǒng)計污染率、褐化死亡率、誘導率。

培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件:以MS為基本培養(yǎng)基，添加2 mg·L－16 －BA+0.5 mg·L－1NAA+30 g·L－1蔗糖 +6.5 g·L－1瓊脂，pH值調(diào)至5.8。每瓶內(nèi)盛30 mL固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度 25 ℃;光照強度 50 μmol·m－2·s－1;光期 14 h，暗期 10 h;相對濕度50%～70%。

表1 對葉片(莖段)不同消毒處理的正交設(shè)計

愈傷組織誘導培養(yǎng)基篩選:采用單因素設(shè)計，以WPM、改良DKW、MS、改良MS、DY、B5六種基本培養(yǎng)基進行誘導試驗。葉片每處理接種10瓶，試驗重復3次。莖段每處理接種5瓶，重復3次。接種后定期觀察，記錄愈傷組織形成開始的時間、接種數(shù)、誘導出的愈傷組織數(shù)目、污染數(shù)目、褐化死亡數(shù)目，30 d后統(tǒng)計誘導率、褐化率。培養(yǎng)期間及時取出污染的外植體，以免交叉污染。

植物生長調(diào)節(jié)劑種類及質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導的影響:采用 KT、2，4 － D、NAA 三因素［4］，三水平 L9(33)正交試驗設(shè)計(表2)。以MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g·L－1蔗糖+6.5 g·L－1瓊脂，pH值調(diào)至5.8。每處理接種15瓶，每瓶接3個葉片。接種后定期觀察，記錄愈傷組織形成開始的時間、接種數(shù)、誘導出的愈傷組織數(shù)目、誘導率、愈傷組織的顏色狀態(tài)。30 d后統(tǒng)計誘導率。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類及其質(zhì)量濃度對愈傷組織誘導的正交設(shè)計

觀察統(tǒng)計:培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計各個處理的污染率、褐化死亡率、誘導率等指標。指標計算方法如下:

污染率=(污染的外植體數(shù)目/接種的外植體數(shù)目)×100%;

褐化死亡率=(褐化死亡的外植體數(shù)目/未污染的外植體數(shù)目)×100%;

誘導率=(誘導出愈傷組織的外植體數(shù)目/未污染的外植體數(shù)目)×100%。

數(shù)據(jù)分析:試驗數(shù)據(jù)利用Excel、STST統(tǒng)計分析軟件進行方差、極差等分析，并用Duncan氏法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方法的篩選

利用不同消毒方法對青錢柳葉片及莖段愈傷組織進行誘導，篩選出最合適的培養(yǎng)基組合。參試酒精和升汞配比的葉片愈傷組織污染率依次為 10.00%、6.67%、6.67%、3.33%、3.33%、3.33%、0、0、0;死亡率依次為 3.70%、7.14% 、17.86% 、20.69%、27.59%、31.03%、33.33%、40.00%、50.00%;誘導率依次為 96.30% 、92.86%、82.14%、79.31%、72.41%、68.97%、66.67%、60.00%、50.00%。由表3可看出，葉片消毒滅菌的最佳組合為70%酒精0 s+0.1%升汞4 min，與其他處理相比，差異均達極顯著水平(p＜0.01)。極差分析結(jié)果表明，酒精的處理時間是影響消毒和誘導效果的主要因素。而升汞的處理時間對消毒和誘導效果的影響不明顯。2種消毒液配合使用并準確控制消毒時間，才能使污染率、死亡率控制在最低，以減少對葉片組織細胞的傷害，進而得到較高的誘導率。參試酒精和升汞配比的莖段愈傷組織污染率依次為33.33%、25.00%、21.74%、13.04%、9.09%、4.76%、8.33%、4.55%、0;死亡率依次為 5.56%、11.11%、22.22%、5.00%、10.00%、20.00%、13.64%、19.05%、37.04%;誘導率依次為 94.44%、88.89% 、77.78% 、95.00% 、90.00%、80.00%、86.36%、80.95%、62.96%。莖段消毒滅菌的最佳組合為70%酒精10 s+0.1%升汞4 min，其次為70%酒精10 s+0.1%升汞8 min，差異不顯著(p＞0.05)。極差分析結(jié)果也和葉片存在差異，酒精是影響消毒滅菌的主要因素，而升汞是影響誘導率的主要因素。因此，以莖段作外植體，酒精應控制在10 s，升汞應控制在4～8 min，此時的污染率較低，愈傷組織的誘導率較高。

表3 不同消毒處理對青錢柳葉片(莖段)愈傷組織誘導正交試驗極差分析

2.2 培養(yǎng)基對愈傷組織誘導的影響

表4結(jié)果顯示，6個基本培養(yǎng)基對葉片愈傷組織誘導影響效果由大到小的順序為 MS、DY、改良 MS、WPM、DKW、B5，其中MS效果最佳，誘導率最高(96.37%)，褐化率最低(3.63%)。與其他處理差異均達極顯著水平(p＜0.01)。其次為DY和改良MS，誘導率分別為89.02%和88.28%。褐化率也較低分別為10.98%和11.72%。B5效果最差，誘導率最低(57.03%)，褐化率最高(42.97%)。從顏色狀態(tài)來看，MS、改良MS、DY培養(yǎng)基的愈傷組織較好，松散、淡綠色或白色，適于增殖培養(yǎng)。與葉片不同，基本培養(yǎng)基對青錢柳莖段愈傷組織誘導的影響效果由大到小的順序為:改良 MS、DY、B5、MS、DKW、WPM。其中改良MS的誘導率最高(95.56%)，褐化率最低(4.44%)，其次為 DY 誘導率為91.11%，褐化率為 9.23%，和其他處理相比達極顯著差異(p＜0.01)。MS、改良MS、DY培養(yǎng)基的愈傷組織的顏色狀態(tài)和葉片相似。

表4 基本培養(yǎng)基對青錢柳葉片(莖段)愈傷組織誘導的影響

2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導和顏色狀態(tài)的影響

培養(yǎng)基配方是否適當直接影響外植體的分化與生長，各種生長調(diào)節(jié)劑的配比顯得尤為關(guān)鍵［5］。本試驗參試激素配比的愈傷組織誘導率依次為66.67%、70.00%、82.93%、72.09%、67.50%、97.50%、68.18%、61.90%、85.00%。由表 6 可看出 KT0.5 mg·L－1+2，4 －D2.0 mg·L－1效果最好，誘導率最高。與其他處理相比，差異達顯著水平(p＜0.05)。極差分析結(jié)果表明，2，4－D質(zhì)量濃度對葉片愈傷組織的誘導影響最大，是影響誘導率的主要因素。隨著2，4－D質(zhì)量濃度的增大誘導率逐漸增大，最佳質(zhì)量濃度為2.0 mg·L－1。其次為KT，而NAA的影響效果最小。最佳激素和質(zhì)量濃度組合為KT0.5 mg·L－1+2，4 － D 2.0 mg·L－1+NAA0.1 mg·L－1。表6結(jié)果也顯示，不同生長調(diào)節(jié)劑配比對愈傷組織生長量和顏色狀態(tài)也存在不同的影響作用，且和誘導率相符，即誘導率愈高的組合，愈傷組織的生長量也越多。

表5 植物生長調(diào)節(jié)劑對青錢柳葉片愈傷組織誘導的正交試驗極差分析

表6 植物生長調(diào)節(jié)劑對青錢柳葉片愈傷組織顏色狀態(tài)的影響

3 結(jié)論與討論

升汞作為組培常用的外植體滅菌消毒劑，消毒效果較好。但處理時間過長易對外植體產(chǎn)生傷害和導致褐變，時間過短則又不能消毒徹底［6］。本研究表明，青錢柳葉片和莖段消毒滅菌的最佳組合分別為70%酒精0 s+0.1%升汞4 min和70%酒精10 s+0.1%升汞4 min。污染率和褐化死亡率最低，愈傷組織誘導率最高。由于葉片誘導愈傷組織量較多，污染率和褐化死亡率相對較低，為獲得大量優(yōu)質(zhì)的愈傷組織，選用青錢柳葉片作為誘導愈傷的外植體材料較為適宜。

基本培養(yǎng)基的組成直接影響細胞的生長及次生代謝物的產(chǎn)生，其中氮源的影響較為明顯［7－10］。上官新晨［4］等的研究結(jié)果表明，改良MS培養(yǎng)基不僅有利于愈傷組織的生長。有研究表明［11］，還原態(tài)NH+4對植物脫分化形成愈傷組織是有利的，且不能被硝態(tài)氮(NO3－)所代替，培養(yǎng)基中適當比例的NH4+/NO3－能促進愈傷組織的生長。本研究表明，青錢柳莖段在改良MS培養(yǎng)基上誘導效果最好，葉片在MS培養(yǎng)基上效果最好，其原因可能是青錢柳愈傷組織誘導需要稍高比例的氨態(tài)氮和硝態(tài)氮。

生長素和細胞分裂素有效結(jié)合時，能更強烈地刺激愈傷組織的形成［12］。一般高質(zhì)量濃度的生長素和低質(zhì)量濃度的細胞分裂素有利于愈傷組織的誘導。本試驗KT0.5 mg·L－1+2，4 －D2.0 mg·L－1組合效果最好，誘導率最高(97.50%)。李玉靜等［13］認為2，4－D是誘導愈傷組織必不可少的因子，與6－BA配合使用對愈傷組織的培養(yǎng)效果更好，當2，4－D為2.0 mg·L－1、6 － BA 為0.5 mg·L－1時水稻愈傷組織的誘導率最高。本試驗結(jié)果表明，2，4－D在愈傷組織的誘導過程中起了決定性的作用，最佳質(zhì)量濃度為2 mg·L－1;但高質(zhì)量濃度的2，4－D使愈傷組織松散且褐化增多，與楊婷婷等［14］的研究結(jié)果類似。可能是高質(zhì)量濃度的2，4－D會增強愈傷組織內(nèi)多酚氧化酶活性，從而導致愈傷組織褐化甚至變黑死亡［4］。因此，在青錢柳愈傷組織的誘導中，應盡量減少2，4－D的用量，以得到顏色、狀態(tài)較好的愈傷組織，為后期的增殖和分化打下良好的基礎(chǔ)。

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