刁桂萍 楊傳平 王玉成

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

二色補(bǔ)血草(Limonium bicolor)屬藍(lán)雪科補(bǔ)血草屬，2年生草本植物，是我國(guó)北方的一種重要牧草資源。它能在pH值8.5～9.0的堿性土壤中正常生長(zhǎng)，是一種泌鹽植物，具有較強(qiáng)的抗鹽能力，不必改良土壤即可直接種植，是進(jìn)行植物耐鹽堿基因克隆的理想材料之一［1］。

有氧環(huán)境下，各種生物的代謝產(chǎn)物中普遍含有活性氧(ROS)。ROS能與蛋白質(zhì)、脂類和DNA反應(yīng)，分別引起酶活降低、膜透性增強(qiáng)及突變?cè)黾樱?］。ROS一旦超出了植物的清除能力，會(huì)造成植物體氧化損傷［3］。近來(lái)認(rèn)為硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶(TPx)可能是ROS代謝中未被發(fā)現(xiàn)的重要環(huán)節(jié)。TPx屬于過(guò)氧化物酶超家族(Prx)中的一員，廣泛存在于原核和真核生物體中。它以硫氧還蛋白作為電子供體去除機(jī)體內(nèi)的活性氧類物質(zhì)(ROS)，不僅具有強(qiáng)大的抗氧化功能，而且在維持機(jī)體氧化還原平衡、細(xì)胞凋亡、增殖等方面都具有調(diào)節(jié)作用［4－6］。本文克隆了二色補(bǔ)血草的 LbTPx基因，對(duì)該基因的序列進(jìn)行了分析，并用實(shí)時(shí)定量RT－PCR分析了該基因在NaCl、CdCl2、CuSO4、ZnCl2和 ABA 等 5 種脅迫下不同時(shí)間的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 二色補(bǔ)血草LbTPx基因的克隆及序列測(cè)定

已構(gòu)建了0.4 mol/L NaHCO3脅迫下的二色補(bǔ)血草葉片及嫩莖的cDNA文庫(kù)，通過(guò)對(duì)文庫(kù)克隆的隨機(jī)測(cè)序和EST分析獲得LbTPx基因的全長(zhǎng)cDNA序列。采用NCBI的開放讀碼框?qū)ふ页绦颍_定該基因的開放讀碼框;用NCBI的Conserved Domains工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白的保守區(qū);通過(guò) ExPASY網(wǎng)站(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)計(jì)算蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn);用BlastP程序進(jìn)行同源性搜索，并對(duì)具有同源性、不同植物來(lái)源的TPx蛋白用ClustalX(1.83)進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.2 二色補(bǔ)血草LbTPx基因在非生物脅迫逆境下的表達(dá)分析

1.2.1 材料處理

將二色補(bǔ)血草種在溫室花盆中，生長(zhǎng)基質(zhì)為沙和草炭土，二者體積比為2∶1。溫室的溫度為24℃，平均光強(qiáng)為400 μmol·m－2·s－1，相對(duì)濕度在 65%～ 75% 之間，每天澆水，保證土壤水分充足。種子萌發(fā)生長(zhǎng)2個(gè)月后，取2月齡的二色補(bǔ)血草幼苗分別用 0.2 mol/L NaCl、150 μmol/L CdCl2、150 μmol/L CuSO4、150 μmol/L ZnCl2和 150 μmol/L ABA 溶液澆灌土壤進(jìn)行脅迫處理。分別在脅迫后0、6、24、48 h取二色補(bǔ)血草的葉片(地上部分)和根部組織，用蒸餾水清洗，拭干后置于－70℃中保存，用于RNA的提取。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量RT－PCR分析基因的表達(dá)

采取 CTAB法［7］提取二色補(bǔ)血草總 RNA，并用 DNaseΙ(Promega公司)消化，去除 DNA。然后參照TaKaRa Prime-ScriptTMRT試劑盒(大連寶生物公司 Code:DRR037S)，以消化后的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量RT－PCR模板。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix(Toyobo Co.，Ltd，Osaka，Japan)。反應(yīng)體系為:2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μL，引物各 0.5 μL(濃度為 10 μmol/L)，水 7 μL，模板 2 μL。定量 PCR 反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性30 s;94℃ 12 s，58℃ 30 s，72℃ 40 s;81℃讀板1 s，45個(gè)循環(huán)，然后在熒光定量PCR儀上完成RT－PCR。用18S rRNA(EU039827)和β－Tublin(EH793552)基因作為內(nèi)參基因。引物序列見(jiàn)表1。

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 二色補(bǔ)血草LbTPx基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析

經(jīng)BlastX分析顯示該基因cDNA全長(zhǎng)為1 016 bp，其中:5’非翻譯區(qū)146 bp，3’非翻譯區(qū)69 bp。對(duì)其ORF進(jìn)行分析，自147位的ATG起，止于947位的TGA，開放閱讀區(qū)全長(zhǎng)為801 bp，共編碼266個(gè)氨基酸。通過(guò)ExPASY網(wǎng)站(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)在線分析，計(jì)算該基因編碼蛋白的分子質(zhì)量為 47.99×10－24kg，理論等電點(diǎn)為 8.83，此蛋白為堿性蛋白質(zhì)。二色補(bǔ)血草LbTPx編碼區(qū)序列及由此推導(dǎo)的氨基酸見(jiàn)表2。

2.2 二色補(bǔ)血草LbTPx基因蛋白質(zhì)序列保守區(qū)預(yù)測(cè)

用 NCBI的 Conserved Domains 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測(cè)蛋白的保守區(qū)。如圖1所示，根據(jù)預(yù)測(cè)的保守區(qū)結(jié)果可知，該基因?qū)儆?－Cys類Prx家族的硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶基因，具有一個(gè)典型的2－CysPrx亞家族結(jié)構(gòu)域。

2.3 二色補(bǔ)血草LbTPx與其他植物TPx蛋白氨基酸序列同源性

利用Blastp進(jìn)行蛋白質(zhì)序列相似性搜索，選擇了9種與二色補(bǔ)血草LbTPx蛋白氨基酸序列相似性較高的植物TPx氨基酸序列，用ClustalX(1.83)進(jìn)行多序列比對(duì)分析(見(jiàn)表3)。從多序列比對(duì)結(jié)果可以看出，氨基酸個(gè)數(shù)從258～288不等，變化不大。但是這10種植物氨基序列的同源性很低，在60%～65%之間。

2.4 二色補(bǔ)血草LbTPx基因在非生物脅迫中的表達(dá)模式

為了研究LbTPx基因在鹽、ABA、重金屬不同脅迫處理下的表達(dá)模式，進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR(見(jiàn)表4)。由表4可見(jiàn):在ABA脅迫下，葉中LbTPx的表達(dá)量除了在脅迫6 h時(shí)表達(dá)量略低于0 h外，其余的表達(dá)量都顯著高于0 h(P＜0.01)。而在根中ABA抑制了LbTPx基因的表達(dá)。CuSO4處理和NaCl處理時(shí)LbTPx基因在根和葉中的表達(dá)量明顯高于對(duì)照0 h(P＜0.01)，在脅迫24 h時(shí)LbTPx基因在葉中的表達(dá)量達(dá)到最高峰，說(shuō)明CuSO4和鹽脅迫誘導(dǎo)了 LbTPx基因的表達(dá)。CdCl2和ZnCl2脅迫時(shí)，LbTPx基因在葉中的表達(dá)量明顯高于0 h，并且隨著時(shí)間進(jìn)程而明顯上升，在脅迫48 h時(shí)達(dá)到最大值;但LbTPx基因在根中的表達(dá)受到了抑制?？傮w而言，不同脅迫下，LbTPx基因在根中的表達(dá)量總是低于葉部。以上結(jié)果說(shuō)明，LbTPx基因能夠?qū)?NaCl、ABA、CuSO4、CdCl2及 ZnCl2等非生物脅迫作出應(yīng)答。

表2 二色補(bǔ)血草LbTPx編碼區(qū)序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列

圖1 二色補(bǔ)血草LbTPx蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

隨著對(duì)過(guò)氧化物酶研究的不斷深入，人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到它在生物體內(nèi)的重要性。過(guò)氧化物酶在生物體內(nèi)的主要功能是細(xì)胞脫毒能力，抵抗氧化壓力和調(diào)節(jié)由過(guò)氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。TPx屬于過(guò)氧化物酶超家族(Prx)中的一員，廣泛存在于酵母、真菌、植物、哺乳動(dòng)物和人類等多種生物體內(nèi)。研究表明，硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶能夠清除氧自由基而具有抗氧化脅迫的能力。

本研究從二色補(bǔ)血草cDNA文庫(kù)中分離出一個(gè)編碼硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶的基因，將其命名為L(zhǎng)bTPx。生物信息學(xué)分析表明，LbTPx基因?qū)儆?－Cys類Prx超家族成員之一。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，在不同的非生物脅迫條件下，LbTPx基因的表達(dá)模式不同。NaCl和CuSO4脅迫均能誘導(dǎo)LbTPx基因在二色補(bǔ)血草根和葉中的表達(dá);ABA、ZnCl2和CdCl2處理則只能誘導(dǎo)LbTPx基因在二色補(bǔ)血草葉中的表達(dá)，而抑制其在二色補(bǔ)血草根中的表達(dá)。此外，LbTPx基因在二色補(bǔ)血草葉部器官和根部器官的表達(dá)量具有明顯的差異，LbTPx在二色補(bǔ)血草葉中的表達(dá)量明顯高于根中，說(shuō)明該基因的表達(dá)具有一定的組織器官特異性。

表3 二色補(bǔ)血草LbTPx氨基酸序列與其它9種植物TPx氨基酸序列比較

表4 實(shí)時(shí)定量PCR分析二色補(bǔ)血草中LbTPx基因在根、葉中的表達(dá)模式

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)TPx的研究還剛剛起步，而且已知的植物TPx基因數(shù)量不多。因此，從不同植物中克隆TPx基因，并對(duì)其在不同逆境下的不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步了解TPx基因的功能極為必要。本研究克隆了二色補(bǔ)血草的LbTPx基因，并對(duì)其在重金屬、鹽和ABA脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，有助于進(jìn)一步了解LbTPx基因的功能。

［1］張寶田.耐鹽堿的二色補(bǔ)血草［J］.植物雜志，2001(5):21.

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［3］Desikan R，A-H-Mackerness S，Hancock J T，et al.Regulation of the arabidopsis transcriptome by oxidative stress［J］.Plant Physiology，2001，127:159－172.

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［7］王玉成，薄海俠，楊傳平.胡楊、檉柳總RNA提取方法的建立［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31(5):99－100.