馬武開(kāi)，李玉瑩，姚血明，王 瑩，黃禮明

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，貴州貴陽(yáng) 550003)

在白血病細(xì)胞的耐藥機(jī)制中，核周因子NF-κB與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、增殖、分化、凋亡及耐藥有密切關(guān)系，是多藥耐藥(multidrug resistance，MDR1)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要信號(hào)分子，在白血病細(xì)胞表達(dá)與耐藥有關(guān)的因素中可能起關(guān)鍵的調(diào)控作用。本研究采用血清藥理學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)研究解毒化瘀藥含藥血清對(duì)人白血病耐藥細(xì)胞系K562/A02細(xì)胞NF-κB信號(hào)的影響，探討解毒化瘀藥對(duì)K562/A02耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1解毒化瘀方含藥血清的制備［1］新西蘭大白兔10只灌服解毒化瘀方水煎液(藥物由青黛、山慈姑、蚤休、虎杖、莪術(shù)、川芎、丹參、補(bǔ)骨脂等組成，按高劑量12 g生藥·kg－1灌服，即正常成人用量的2倍)，每日1次，連續(xù)3 d，于末次給藥后2 h無(wú)菌條件下心臟取血，分離血清，組內(nèi)血清混合，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，置－20℃保存?zhèn)溆?。正常兔血清制?灌藥前1 d取兔血，分離血清，方法同前。

1.2主要試劑和儀器主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco)、胎牛血清(杭州四季青)、RT-PCR試劑盒(南京凱基生物科技)。主要儀器:PCR梯度循環(huán)儀(美國(guó))、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津)、凝膠成像分析系統(tǒng)(GE Healthcare)。

1.3 含藥血清的細(xì)胞毒作用將K562、K562/A02細(xì)胞懸液1 ×109·L－1加入 96 孔板中，每孔 100 μl，適應(yīng)性的培養(yǎng)12 h，實(shí)驗(yàn)組用各濃度含藥血清培養(yǎng)(共10個(gè)濃度)，以不含藥正常培養(yǎng)的K562和K562/AO2細(xì)胞為對(duì)照組，另外設(shè)調(diào)零孔，最終每孔為200 μl。37℃，5%CO2孵育 48 h，每孔加入5 g·L－1的MTT磷酸緩沖液20 μl，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，離心(1 000 r·min－1，5min)，棄上清，每孔加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀檢測(cè)，計(jì)算各組細(xì)胞毒性。

1.4含藥血清對(duì)MDR1的表達(dá)影響采用RT-PCR法，按試劑說(shuō)明書提取 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 RNA純度(A260/A280＞1.7)，進(jìn)行RNA定量。重復(fù)3次，取平均值。

1.5含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞NF-κB信號(hào)的影響采用Western blot法檢測(cè)含藥血清處理后K562/A02細(xì)胞株NF-κB/p65、NF-κB/p50、IκBα 的表達(dá)，并設(shè) K562 細(xì)胞作對(duì)照。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，方差齊采用SNK法檢驗(yàn)，如方差不齊則用Dunnett’s檢驗(yàn)。藥物濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率采用一元線性回歸相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1含藥血清濃度的選擇將解毒化瘀藥含藥血清調(diào)為10個(gè)不同濃度劑量，分別加入K562/A02細(xì)胞，根據(jù)含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的一元線性回歸分析求得到IC50為＞3 g生藥·kg－1體質(zhì)量。本試驗(yàn)低劑量組采用0.5g生藥·kg－1體質(zhì)量含藥血清，中劑量組采用1.5 g生藥·kg－1體質(zhì)量含藥血清，高劑量組采用3 g生藥·kg－1體質(zhì)量含藥血清(Fig 1);干擾素參照文獻(xiàn)［3］采用500 U·L－1。

2.2含藥血清對(duì)MDR1 mRNA的表達(dá)水平的影響K562細(xì)胞未見(jiàn)陽(yáng)性條帶，K562/A02細(xì)胞牛血清組、兔血清組可見(jiàn)陽(yáng)性條帶，經(jīng)中藥高、中、低劑量含藥血清和干擾素處理后MDR1 mRNA條帶均變淺。MDR1/β-actin cDNA灰度比值結(jié)果示K562/A02細(xì)胞MDR1 mRNA水平較K562細(xì)胞高(P＜0.01);含藥血清和干擾素均能降低K562/A02細(xì)胞MDR1 mRNA表達(dá)。

2.3含藥血清對(duì)K562/A02細(xì)胞NF-κB信號(hào)干預(yù)的影響K562未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，牛血清組和兔血清組K562/A02細(xì)胞p65、p50和IκBα均呈陽(yáng)性表達(dá)，加含藥血清處理后p65、p50和IκBα表達(dá)呈現(xiàn)不同程度下降，其比值見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Influence of jieduhuayu Chinese herbal serum on NF-κB signal expression in K562/A02 cell(±s，n=3)

Tab 1 Influence of jieduhuayu Chinese herbal serum on NF-κB signal expression in K562/A02 cell(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs calf serum control;★P＜0.05 vs Alpha Interferon control.

K562 cell 0.435 ±0.375 0.313±0.187 0.087 ±0.032 calf serum 1.140 ±0.170 1.013±0.038 0.847 ±0.150 rabbit serum 1.085 ±0.021 0.995±0.025 0.857 ±0.488 Alpha Interferon 0.575 ±0.134＊＊ 0.823±0.061 0.447 ±0.220＊＊A low-dose herbal serum 0.875 ±0.078* 1.170±0.274 0.520 ±0.165*A middle-dose herbal serum 0.705 ±0.106＊＊ 0.663±0.123＊＊ 0.410 ±0.026＊＊A high-dose herbal serum 0.410 ±0.127＊＊★0.468±0.239＊＊★0.317 ±0.038＊＊★

3 討論

NF-κB參與白血病細(xì)胞耐藥的途徑是由于化療藥物激活NF-κB的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致MDR1及其產(chǎn)物P-gp表達(dá)增加，使細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，抑制其轉(zhuǎn)錄活性則可以增加白血病細(xì)胞的凋亡從而逆轉(zhuǎn)耐藥。在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中，本研究組認(rèn)識(shí)到白血病多藥耐藥的中醫(yī)發(fā)病原因是由于毒邪留戀，擾亂血絡(luò)，導(dǎo)致毒瘀互結(jié)，病情頑纏，反復(fù)發(fā)作［2］。在此理論指導(dǎo)下組成解毒化瘀方，經(jīng)臨床和實(shí)驗(yàn)證明解毒化瘀藥具有逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞耐藥和提高難治復(fù)發(fā)白血病化療緩解率的作用［3－4］。本研究顯示解毒化瘀藥含藥血清能夠降低K562/A02 耐藥細(xì)胞 NF-κB/p65、NF-κB/p50、IκBα 表達(dá)，降低MDR1耐藥基因的表達(dá)，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)耐藥。

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