王孟良，趙佳麗，宋珍鵬，于慧娜，趙 莉

(河南省新鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南 新鄉(xiāng) 453000)

寧神補(bǔ)心片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第二十冊(cè))》，由丹參、五味子、地黃、首烏藤、合歡皮等10味藥材組成，具有養(yǎng)血安神、滋補(bǔ)肝腎之功效，用于肝腎陰血不足所致的頭昏、耳鳴、心悸、健忘、失眠等癥。原標(biāo)準(zhǔn)中收載有丹參的薄層色譜鑒別，本標(biāo)準(zhǔn)為更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，筆者增加了五味子、首烏藤、熟地黃、合歡皮的薄層色譜鑒別和方中君藥丹參活性成分丹酚酸B的含量測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC2010CHT型高效液相色譜儀(島津公司);92SM－202A－DR型電子天平(瑞士);Transilluminator 2020D型紫外透射儀。丹酚酸B 對(duì)照品(批號(hào)為 111562－200706，純度為 96.0%)，5－羥甲基糠醛對(duì)照品(批號(hào)為111626－200906)，五味子甲素對(duì)照品(批號(hào)為110764－200708)，大黃素對(duì)照品(批號(hào)為0756－200211)，五味子、首烏藤、合歡皮對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;熟地黃(本所鑒定合格的藥材);寧神補(bǔ)心片(多廠家提供)。陰性樣品按處方中各藥味比例依法制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 五味子[1]

取本品20片，除去包衣，加甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL、乙醚15 mL，分次交替溶解，全部轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，振搖提取，分取乙醚液，水液加乙醚振搖提取2次，每次15 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺五味子的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取五味子對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取五味子甲素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各5 μL、對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸(11 ∶1 ∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

2.1.2 熟地黃[1]

取本品10片，除去包衣，研細(xì)，加水50 mL，溫?zé)崾钩浞秩苌ⅲ訜嶂练?，放冷，用脫脂棉濾過(guò)，取濾液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺熟地黃的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取熟地黃對(duì)照藥材1 g，剪碎，加水60 mL，煎煮30 min，放冷，用脫脂棉濾過(guò)，取濾液，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取5－羥甲基糠醛對(duì)照品，制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯(1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2，4－二硝基苯肼乙醇試液。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖2)。

圖1 五味子薄層色譜圖

圖2 熟地黃薄層色譜圖

2.1.3 首烏藤[1]

取本品20片，除去包衣，研細(xì)，加20%硫酸液10 mL，三氯甲烷20 mL，加熱回流1 h，放冷，分取三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺首烏藤的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取首烏藤對(duì)照藥材0.25 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取大黃素對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述4種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)－甲酸乙酯－甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干。置氨蒸氣中熏后，供試品溶液色譜中，在對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同的紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖3)。

2.1.4 合歡皮[2]

取本品10片，除去包衣，研細(xì)，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)诱〈?0 mL，水浴加熱5 min，攪拌使溶解，傾取上清液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取缺合歡皮的陰性樣品，同法制成陰性對(duì)照品溶液。另取合歡皮對(duì)照藥材0.2 g，加甲醇20 mL，超聲處理 30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法[2010年版《中國(guó)藥典(一部)》附錄ⅥB]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上(點(diǎn)樣后，薄層板在干燥器中干燥過(guò)夜)，以三氯甲烷 －丙酮 － 甲酸(6∶0.3∶0.2)為展開(kāi)劑，薄層板預(yù)飽和30 min，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾(見(jiàn)圖4)。

圖3 首烏藤薄層色譜圖

圖4 合歡皮薄層色譜圖

2.2 丹酚酸B含量測(cè)定[1]

2.2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Gemini C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 －乙腈 －水 －甲酸(30∶10∶59∶1);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm;進(jìn)樣量:10 μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算不低于2 000。

2.2.2 溶液制備

取本品10片，糖衣片除去糖衣，精密稱定，取約0.7 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加75%甲醇適量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)30 min，放冷，加75%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取不含丹皮的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成每1 mL含丹酚酸B 60 μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)選擇

精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀(二極管陣列檢測(cè)器)記錄光譜圖，圖5表明丹酚酸 B在 286.6 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。參考2010年版《中國(guó)藥典(一部)》丹參中丹酚酸B的含量測(cè)定方法，選取檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。

圖5 丹酚酸B紫外光譜圖

2.2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):取丹酚酸B對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液在286 nm波長(zhǎng)處的色譜圖，結(jié)果表明，對(duì)照品溶液及供試品溶液均在保留時(shí)間約12 min處有一吸收峰，陰性對(duì)照品溶液在相應(yīng)的位置上無(wú)吸收峰，說(shuō)明陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾。高效液相色譜圖見(jiàn)圖6。

圖6 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加75%甲醇制成每1 mL含65.8 μg的溶液。分別精密吸取上述溶液 2，5，10，15，20，25，30 μL，注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1 202 173 X+1 981，r=1.000 0(n=7)。結(jié)果表明，丹酚酸 B進(jìn)樣量在0.137 0～2.055 6范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取同一對(duì)照品溶液，依法重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.56%(n=6)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液，分別在制備后0，6，12，24 h時(shí)依法測(cè)定。結(jié)果的 RSD為0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn):精密稱取已知含量的供試品6份，約0.35 g，精密加入一定量對(duì)照品溶液，按2.2下項(xiàng)方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丹酚酸B加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

檢測(cè)限和定量限確定:以信噪比3∶1確定，檢測(cè)限為0.263 μg/mL。以信噪比 10 ∶1 時(shí)連續(xù)進(jìn)樣 5 次，峰面積 RSD=1.3% 對(duì)應(yīng)的濃度確定，定量限為 0.658 μg/mL。

2.2.5 樣品含量測(cè)定

取不同生產(chǎn)廠家8批寧神補(bǔ)心片，依法測(cè)定。結(jié)果批號(hào)分別為100601，20090101，100802，09062901，1004251，20100412，20090101，20100101 的產(chǎn)品含量分別為 3.174，1.718，1.556，2.655，2.260，2.567，2.257，2.811 mg/片。

3 討論

試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)供試品溶液提取對(duì)比了不同溶劑(水和75%甲醇)、提取方法(加熱回流和超聲)和提取時(shí)間(30和60 min)，結(jié)果表明75%甲醇超聲30 min提取最簡(jiǎn)便、完全。原標(biāo)準(zhǔn)中僅有丹參酮ⅡA薄層鑒別，文中增加了五味子、首烏藤、熟地黃、合歡皮的薄層鑒別和丹酚酸B的含量測(cè)定。方法專屬性強(qiáng)，陰性無(wú)干擾，可作為該品種的質(zhì)量控制方法。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:70－905.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中藥材薄層色譜彩色圖集[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:281.