趙妍 李里 姜秋穎 申維喜 武露艷 閻婷婷

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

乳腺癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%，其中有10%～34%屬于Her-2基因過表達(dá)［1］。目前，紫杉醇已成為治療乳腺癌的有效藥物之一。研究證明，乳腺癌細(xì)胞中Her-2基因的過度表達(dá)降低了其對(duì)紫杉醇的敏感性［2-4］，Bcl-2蛋白是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白，有研究報(bào)道，Bcl-2可使腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生抗藥性，相反降低細(xì)胞Bcl-2的水平可使細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感［5］。維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的酯化衍生物，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，卻對(duì)正常細(xì)胞組織沒有毒性作用［6］。研究報(bào)道VES作用于白血病細(xì)胞Raji、前列腺癌細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)下降［7-8］，本研究以VES、紫杉醇單獨(dú)及聯(lián)合作用于Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453，通過檢測(cè)其誘導(dǎo)凋亡率，判斷VES對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

VES為Sigma公司產(chǎn)品；紫杉醇為百時(shí)美施貴寶公司產(chǎn)品；鼠抗人Her-2單抗、SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)有限公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Roche公司(產(chǎn)品規(guī)格：20T，產(chǎn)品貨號(hào)：SK-9000)；流式細(xì)胞儀為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公衛(wèi)學(xué)院提供。

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-453細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；優(yōu)級(jí)胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)基為北京賽默飛世爾生化制品有限公司產(chǎn)品。MDAMB-453細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MDA-MB-453細(xì)胞株Her-2蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-453乳腺癌細(xì)胞株于離心管中離心(1 000 r/min，離心半徑為13.5 cm，5 min)，棄上清液，加中性甲醛固定(甲醛與細(xì)胞量之比為7∶1)后制備成石蠟切片，共制備5張切片，按照Her-2染色試劑盒操作步驟檢測(cè)表達(dá)率。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)該細(xì)胞株的自身凋亡率及VES組和乙醇組MDA-MB-453細(xì)胞株的凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-453細(xì)胞，用RPMI 1640和10%FS培養(yǎng)液充分吹打使細(xì)胞混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)為71×104/mL，為達(dá)到2×106/mL的上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)，于1 000 r/min離心5 min后去上清液，各加1 mL正常培養(yǎng)液充分吹打使細(xì)胞混勻后，吸出移至2個(gè)EP管中并分別標(biāo)記為0和1，再離心棄上清液加PBS沖洗離心3次(1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，5 min)，加 200 μL Binding Buffer，培養(yǎng) 36 h 后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI輕混勻，避光反應(yīng)10 min后追加300 μL Binding Buffer后上機(jī)。乙醇組除所用培養(yǎng)液為0.15%的乙醇+RPMI 1640+10%FS，其他操作同上。VES組除培養(yǎng)液為15 mg/L VES+ RPMI 1640+10%FS，其他操作同 上，以上步驟每組均重復(fù)3次。

1.5 TUNEL法檢測(cè)不同濃度的VES及不同濃度的紫杉醇分別單獨(dú)作用于MDA-MB-453細(xì)胞株的凋亡率

VES以0.15%的乙醇溶解，配制成濃度為10、20 mg/L的VES。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDAMB-453細(xì)胞珠接種于96孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)每孔約1×106個(gè)，加培養(yǎng)液至300 μL，分別用10、20 mg/L的 VES，50、100 nmol/L的 紫 杉醇處理MDA-MB-453細(xì)胞24、48 h后，參照TUNEL試劑盒染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.6 TUNEL法檢測(cè)VES聯(lián)合紫杉醇作用于MDA-MB-453細(xì)胞株的凋亡率

VES聯(lián)合紫杉醇作用于MDA-MB-453細(xì)胞， 共8組， 第1組：VES 10 mg/L， 紫 杉醇50 nmol/L，作用時(shí)間24 h；第2組VES 10 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用時(shí)間48 h；第3組VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時(shí)間24 h；第4組：VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L， 作 用 時(shí) 間 48 h；第 5組：VES 20 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用時(shí)間24 h；第 6組：VES 20 mg/L， 紫 杉 醇 50 nmol/L，作用時(shí)間48 h；第7組：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時(shí)間24 h；第8組：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時(shí)間48 h；各組藥物分別作用于MDA-MB-453細(xì)胞，參照TUNEL試劑盒染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著性比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞MDAMB-453的Her-2表達(dá)水平

5張切片Her-2蛋白表達(dá)率分別為65.30%、68.67%、63.64%、65.12% 和69.57%，其95%CI：63.32%～69.60%，進(jìn)一步驗(yàn)證了MDA-MB-453細(xì)胞為Her-2蛋白過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞(圖1)。

2.2 MDA-MB-453細(xì)胞株的自身凋亡率及VES組和乙醇組作用于該細(xì)胞株的凋亡率

MDA-MB-453細(xì)胞的自身凋亡率為2.1%。0.15%的乙醇作用于MDA-MB-453細(xì)胞株36 h后的凋亡率為2.4%。15 mg/L的 VES作用于MDA-MB-453細(xì)胞株36 h后的凋亡率為9%。和空白對(duì)照組相比，乙醇組凋亡率改變不明顯(P＞0.05)，VES 組凋亡明顯 (P＜0.05)。

2.3 VES和紫杉醇單獨(dú)作用以及聯(lián)合作用于MDA-MB-453細(xì)胞的凋亡率

VES單獨(dú)作用可誘導(dǎo)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞凋亡，并成劑量和時(shí)間依賴關(guān)系；紫杉醇單獨(dú)作用誘導(dǎo)Her-2蛋白過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞凋亡呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)系(表1)。

VES和紫杉醇聯(lián)合作用的TUNL染色結(jié)果見圖2，根據(jù)染色結(jié)果計(jì)算凋亡指數(shù)，可見VES聯(lián)合紫杉醇作用于Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用較兩藥單藥作用時(shí)明顯增強(qiáng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。但這種誘導(dǎo)凋亡作用不成劑量和時(shí)間依賴關(guān)系，其中以10 mg/L的 VES聯(lián)合100 nmol/L的紫杉醇作用時(shí)間為48 h對(duì)MDA-MB-453細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用最強(qiáng)。

表 1 兩種藥物單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)Her-2過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡率Tab.1 The induction of apoptosis by the two drugs in breast cancer cells

3 討 論

乳腺癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤，其發(fā)病率占婦女腫瘤的31%，目前的治療手段基本可以使患者獲得較高的生存率。紫杉醇是治療乳腺癌的有效藥物之一，其機(jī)制主要是促進(jìn)微管聚合和穩(wěn)定已聚合微管，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，激活免疫細(xì)胞等對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷［9-10］。然而，約有30%的乳腺癌患者為Her-2基因過表達(dá)，研究表明其對(duì)化療藥物存在明顯耐藥，常導(dǎo)致化療失?。?1］。Ciardiello等［12］也已證明Her-2基因過表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性下降，為了提高紫杉醇的療效，可以尋找一些紫杉醇化療增敏的途徑。

VES可使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞有特異性的生長(zhǎng)抑制作用，卻對(duì)正常細(xì)胞組織沒有毒性作用。研究表明，VES對(duì)乳腺癌、前列腺癌、舌癌及腎癌等惡性腫瘤均具有顯著的誘導(dǎo)凋亡作用［13-16］。經(jīng)證實(shí)，VES在體外誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，在體內(nèi)對(duì)荷乳腺癌小鼠有抑瘤作用［17-18］。

本實(shí)驗(yàn)用免疫細(xì)胞化學(xué)法驗(yàn)證了MDAMB-453乳腺癌細(xì)胞為Her-2蛋白過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞，以50、100 nmol/L的紫杉醇作用于MDA-MB-453細(xì)胞24、48 h后的誘導(dǎo)凋亡率分別為：15.3%、17.9%、23.5%和29.3%。以10和20 mg/L的VES作用于MDA-MB-453細(xì)胞24、48 h后的凋亡率分別為13.6%、16.28%、45.5%和48.84%。說明紫杉醇和VES對(duì)Her-2蛋白過表達(dá)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453均有誘導(dǎo)凋亡作用，這種作用成濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。本研究再以兩藥聯(lián)合作用于MDAMB-453細(xì)胞，結(jié)果表明兩藥聯(lián)合的誘導(dǎo)凋亡率明顯高于單藥，并證實(shí)兩藥有協(xié)同作用(P＜0.05)，隨著對(duì)VES的深入研究，其有望成為紫杉醇化療藥物發(fā)揮療效的增敏劑。

已證實(shí) Bcl-2蛋白是一種重要的細(xì)胞凋亡抑制蛋白，定位于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及核膜上。有報(bào)道，Bcl-2可使細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生抗藥性，相反降低Bcl-2的水平可使細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感，表明Bcl-2水平與細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥直接相關(guān)。研究證明VES作用于白血病細(xì)胞Raji、前列腺癌細(xì)胞后，Bcl-2蛋白表達(dá)下降，本實(shí)驗(yàn)VES作用于MDA-MB-453細(xì)胞有可能通過降低Bcl-2的水平使腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇敏感而產(chǎn)生協(xié)同作用。此外，紫杉醇將細(xì)胞阻滯于G2/M期，VES可使腫瘤細(xì)胞阻滯于G1期，協(xié)同作用有可能與兩種藥物作用于細(xì)胞的不同周期有關(guān)。但具體機(jī)制需要下一步研究。

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