唐坤甜，趙彩云，谷方紅

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 釀酒工程部，北京 100027)

20世紀70年代以來，在世界范圍內(nèi)，各種真菌毒素在啤酒釀造過程中不斷被發(fā)現(xiàn)，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)在自然界分布最廣泛，毒性最強，對人類和動植物影響最大。OTA的主要產(chǎn)毒菌株包括赭曲霉 (Aspergillus ochraceus)、硫色曲霉 (A.sulphureus)、蜂蜜曲霉 (A.melleus)、菌核曲霉 (A.sclerotiorum)、洋蔥曲霉 (A.alliaceus)、孔曲霉 (A.ostianus)和佩特曲霉 (A.ptrakii)［1-3］。

目前真菌毒素OTA的檢測方法趨于采用特征性選擇的真菌毒素免疫親和柱富集和除雜，運用液相色譜法—熒光檢測器進行分離測定［4］。我國于2005年規(guī)定谷類、豆類中 OTA的限量不超5 μg·kg-1［5］，其推薦檢測方法［6］的最低檢測限為 10 μg·kg-1，不能滿足國家標準對 OTA的限量要求檢測條件。作者選擇免疫親和柱-液相色譜法對全國范圍內(nèi)多個品種大麥的OTA污染情況進行了測定，該方法檢測限為0.25 μg·kg-1，可以滿足標準限量要求。通過對數(shù)據(jù)的分析反映出我國大麥真菌毒素污染情況，對我國啤酒原料選擇和大麥種植儲存有一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

大麥樣品15份，分別取自國內(nèi)4個大麥主產(chǎn)區(qū)的7個省 (自治區(qū))。

儀器設(shè)備有高效液相色譜儀 (配置有紫外檢測器和熒光檢測器，美國 PerkinElmer公司)，ZORBAX SB-C18柱 (美國安捷倫公司)，氮氣吹干儀HGC-12A(北京興華科儀科技發(fā)展有限公司)，醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)，OTA Test HPLC免疫親和柱 (美國VICAM公司)，pH酸度計 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)，微纖維濾紙 (美國VICAM公司)。

試劑藥品有甲醇、乙腈、冰醋酸 (HPLC級色譜純，F(xiàn)isher公司)，DON標準品、OTA標準品(純度 99%，美國 SIGMA公司)，聚乙二醇(PEG)(分子量8000，美國VICAM公司)，磷酸鈉、氯化鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀 (分析純，北京化工廠)，鹽酸 (分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠)，磷酸二氫鉀 (分析純，天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

OTA標準溶液。取1.0 mg OTA標準品于容量瓶中加入甲醇定容至10mL，振搖使之充分溶解，配成濃度為100 mg·L-1的貯備液于冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

PBS緩沖溶液:取 8.0 g氯化鈉，1.2 g磷酸氫二鈉，0.2 g磷酸二氫鉀和0.2 g氯化鉀，溶解到990mL的蒸餾水中，用鹽酸將溶液的pH值調(diào)到7.0，最終用蒸餾水稀釋至1000mL。

1.2.2 樣品前處理

大麥樣品約500 g，充分混合，分成2份，取其中1份粉碎 (細粉)，使粉碎樣品的95%通過20目篩后用于實驗，剩余樣品作為留樣。稱取25 g磨細的樣品，置于錐形瓶中，加入200mL乙腈-水(60∶40)溶液，在搖床上震蕩1.5 h，取出使其至少靜置10 min。提取物倒入槽紋濾紙上，濾液收集于干凈的容器中，取10mL的濾液放到50mL的燒杯中，加入40mL的 PBS緩沖溶液，搖勻待用。將免疫親和柱連接于10mL玻璃注射器下，準確移取10mL上述稀釋液注入玻璃注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使溶液以約1滴·s-1流速緩慢通過免疫親和柱，直至2～3mL空氣通過柱體。然后用5mL PBS溶液以1～2滴·s-1的速度淋洗柱子1次，直至2～3mL空氣通過柱體，再用5mL蒸餾水以 1～2滴·s-1的速度沖洗柱子，棄去全部流出液，并使2～3mL空氣通過柱體。準確加入1.5mL甲醇洗脫，流速為1滴·s-1，收集洗脫液于玻璃試管中，用氮氣吹干，然后用0.25mL流動相定容進樣分析。1.2.3 色譜分析條件

色譜柱:ZORBAX SB-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-水-乙酸 (49.5∶49.5∶1);流速:1.0mL·min-1;進樣量:100 μL;檢測器:熒光檢測器;激發(fā)波長:331.0 nm;發(fā)射波長:464.0 nm。

2 結(jié)果與分析

大麥檢測結(jié)果，譜圖見圖1，數(shù)據(jù)見表1。

表1 大麥樣品中的OTA含量

所測樣品中的OTA的含量范圍為0.041～0.21 μg·kg-1，均低于我國國標限量。各個地區(qū)大麥的OTA含量平均值比較一致，都在0.1 μg·kg-1左右，新疆、黑龍江、甘肅、江蘇各有一個在0.2 μg·kg-1左右的較大值，由此可見各地該年度OTA含量水平相差不大。本次試驗初步分析了我國大麥的OTA的情況，數(shù)據(jù)有限，且僅選取同一年份的大麥樣品，得出的結(jié)論只是一些初步的認識。后期試驗可根據(jù)不同年份的氣候、存儲條件等有目的地選取各個品種和地區(qū)的大麥跟蹤監(jiān)測，以期能夠找出影響我國大麥OTA含量的具體因素和影響方式。

圖1 大麥OTA分析譜圖

從以往的數(shù)據(jù)來看，我國也存在OTA的污染問題，1990年蔡梅等對江蘇省玉米和小麥中OTA的污染情況作調(diào)查，發(fā)現(xiàn)小麥的污染率為3%，玉米和大米的污染率為2%，含量范圍8.00～36.36 μg·kg-1，平均為 19.24 μg·kg-1［7］。OTA 作為一種天然污染物，存在于多種食品和飼料中，特別是那些處于溫帶地區(qū)的國家尤其嚴重。德國、英國、加拿大、美國和北歐各國均報道了各類糧食制品及飼料中的OTA污染情況。市售的葡萄酒、葡萄、葡萄汁、干果、咖啡豆、可可粉及其產(chǎn)品中，均有OTA 的檢出［8-11］。

3 小結(jié)

采用免疫親和柱-液相色譜法測定我國大麥產(chǎn)區(qū)的15個大麥樣品，方法靈敏度高，檢測限可以達到 0.25 μg·kg-1，能滿足我國赭曲霉毒素 10 μg·kg-1的限量要求。

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