鐘 石，李有貴，朱儉勛，林天寶，呂志強(qiáng)，葉偉清

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021;2.桐廬縣農(nóng)技推廣中心 蠶桑站，浙江 桐廬 311500)

桑黃 (Phellinus igniarius)學(xué)名鮑氏層孔菌，屬擔(dān)子菌亞門，層菌綱，多孔菌目，多孔菌科，針層孔菌類真菌，俗稱桑臣、桑黃菇等，是寄生于桑樹等闊葉樹的一種藥用真菌，因?yàn)榫哂歇?dú)特的抗癌等功效，已引起國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥界與保健品行業(yè)的關(guān)注［1-3］。近年來(lái)，日本、韓國(guó)相繼對(duì)其進(jìn)行開發(fā)，主要應(yīng)用于肝炎及癌癥的治療，療效顯著。據(jù)有關(guān)資料顯示，桑黃對(duì)腫瘤抑制率高達(dá)96.78%，是目前國(guó)際公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中有效率最佳的藥用真菌［4-8］。

由于國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)桑黃的需求量越來(lái)越大，致使國(guó)內(nèi)各產(chǎn)地藥農(nóng)掠奪性采集，子實(shí)體孢子無(wú)法大量形成，野生桑黃面臨枯竭。采用液體深層培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)桑黃菌絲體是滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需要的有效途徑。為此我們探討了桑黃菌液體發(fā)酵的適宜培養(yǎng)基，以便為進(jìn)一步研究液體發(fā)酵工藝及提取桑黃有效成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

桑黃 (Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel)，由本試驗(yàn)室從浙江桐廬桑園桑樹上寄生的野生桑黃子實(shí)體中分離。

1.1.2 試劑

乳糖、葡萄糖、蔗糖、KH2PO4、MgSO4等均為國(guó)產(chǎn)分析純，玉米粉、酵母粉、麥胚等提取液均為煮沸20 min后用濾布過(guò)濾制得。

1.1.3 儀器

華利達(dá)HZ-9610K冷凍振蕩培養(yǎng)箱，Christ ALPHA 1-2LD冷凍干燥機(jī)，Mettler Toledo AL204電子天平。

1.2 方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

母種選用PDA培養(yǎng)基;液體母種培養(yǎng)基為:20%馬鈴薯，2%白砂糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4。

液體菌種培養(yǎng)條件:液體母種用均質(zhì)機(jī)1000 r·min-1勻漿處理1 min用于接種，50mL三角瓶中裝液體菌種培養(yǎng)基 20mL，25℃，120 r·min-1振蕩培養(yǎng)8 d。

1.2.2 氮源篩選

2% 白 砂 糖，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分別以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米粉、酵母浸出粉、麥胚粉、土豆粉為氮源，添加量 20 g·L-1。

1.2.3 碳源篩選

20%馬鈴薯，0.05%KH2PO4，0.05%MgSO4，pH值自然，分別以葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、白砂糖、紅糖為碳源，添加量20 g·L-1。

1.2.4 無(wú)機(jī)鹽篩選

20%馬鈴薯，2%白砂糖，pH值自然，以KH2PO4、MgSO4、K2HPO4、CaCl2、 (NH4)3C6H5O7(檸檬酸三銨)為無(wú)機(jī)鹽篩選對(duì)象，添加量為1.0 g·L-1。

1.2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化

以麥芽糖、酵母粉為碳、氮源，添加KH2PO4、MgSO4、檸檬酸三銨、復(fù)合維生素B，設(shè)計(jì)L18(36)6因素3水平正交試驗(yàn) (表1)，優(yōu)化培養(yǎng)基配方。

表1 L18(36)正交試驗(yàn)的因素與水平

1.2.6 添加桑枝提取物

在優(yōu)化的培養(yǎng)基中分別添加桑枝提取物，添加量分別為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7%和0.8%。

1.3 測(cè)定方法

發(fā)酵液8000 r·min-1離心后收集菌絲體，用水清洗3次，冷凍干燥后稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基配方

由圖1可知，不同碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的桑黃菌絲體生物量由大到小順序依次為:麥芽糖＞葡萄糖＞紅糖＞蔗糖＞白砂糖。

圖1 碳源對(duì)桑黃菌絲體干物重的影響

不同氮源的菌絲體生長(zhǎng)也有明顯差異，以酵母粉作氮源，產(chǎn)量最高，達(dá)14.37 g·L-1，其次分別為酵母膏和麥胚粉，以土豆作氮源的產(chǎn)量最低 (圖2)。

添加不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)桑黃菌絲體干物重影響較大，其中檸檬酸三銨效果較為明顯 (圖3)。

考慮到鎂鹽和磷酸鹽對(duì)普通微生物發(fā)酵的重要性，選取檸檬酸三銨、KH2PO4、MgSO4作礦質(zhì)元素添加。同時(shí)在培養(yǎng)基中添加微量復(fù)合維生素B有利于桑黃生物量的增加，隨著用量的增加，菌絲體干物重反而逐漸減小 (圖4)。

圖2 氮源對(duì)桑黃菌絲體干物重的影響

圖3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)桑黃菌絲體干物重的影響

圖4 復(fù)合維生素B對(duì)桑黃菌絲體干物重的影響

2.2 培養(yǎng)基優(yōu)化

由表2的L18(36)試驗(yàn)因素及水平分析可知，菌絲體生物量的最優(yōu)培養(yǎng)基配方組合為A3B2C3D1E3F1，菌絲體生物量為 20.23 g·L-1，確定桑黃的液體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:麥芽糖30 g·L-1，酵 母 粉 20 g · L-1，MgSO41.5 g·L-1，KH2PO41.0 g·L-1，檸檬酸三銨 1.0 g·L-1，復(fù)合維生素B 0.01%。

表2 各處理組合對(duì)菌絲體干物重的影響

2.3 添加桑枝提取物

添加不同濃度的桑枝提取物對(duì)桑黃生物量的影響有一定的差異 (圖5)，在一定范圍內(nèi)，隨著桑枝水提物添加量的增加，菌絲體干物重也隨之增加，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入0.3%桑枝水提物時(shí)，菌絲體干物量則達(dá)24.48 g·L-1，之后則隨著添加量的增加，菌絲發(fā)生自溶現(xiàn)象，生物量也隨之逐漸降低。

圖5 添加桑枝提取物對(duì)桑黃菌絲體干物重的影響

3 小結(jié)與討論

在我國(guó)，桑黃入藥已有2000多年的歷史，最早記載始于 《本草綱目》。由于桑黃生長(zhǎng)需要較為特殊的自然氣候環(huán)境，生長(zhǎng)期長(zhǎng)，因而天然桑黃數(shù)量非常稀少，因此采用液體深層培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)桑黃菌絲體將是一個(gè)有效途徑。

以菌絲體干物重為基礎(chǔ)，對(duì)野生桑黃菌絲體液體發(fā)酵的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)元素 (氮源、碳源、礦物元素、復(fù)合維生素B)進(jìn)行篩選，獲得優(yōu)化的菌絲體液體配方:3%麥芽糖，2%酵母粉，0.15%MgSO4，0.10%KH2PO4，0.10% 檸 檬 酸 三 銨，0.3%桑枝水提物，0.01%復(fù)合維生素B。

考慮寄生于桑樹之上的桑黃為其中正品，因此我們?cè)趦?yōu)化了高效生產(chǎn)桑黃菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中引入桑枝提取物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑枝提取物不僅對(duì)桑黃菌絲體生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，而且相對(duì)于對(duì)照組，添加桑枝提取物后，菌絲體顏色較深，不容易退化成白色，這可能是因?yàn)樯Ｖμ崛∥镏械哪承┪镔|(zhì)可以在一定程度上延緩菌種退化的時(shí)間，至于兩者之間的藥效是否存在差異還有待于進(jìn)一步研究。

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