楊旭東 張 杰 包?；?/p>

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，也是常見的視網(wǎng)膜血管病，其發(fā)病機制尚不十分明了。細胞凋亡在DR發(fā)生發(fā)展中的作用已逐漸受到大家的重視。牛膝系莧科牛膝屬植物，入肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、強筋骨、引血下行之功效?，F(xiàn)代藥學研究認為牛膝具有降血糖、利尿，以及抗腫瘤和增強免疫功能等多種藥理作用〔1，2〕。本實驗對牛膝多糖對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的保護作用及其機制進行了初步研究，為臨床應用牛膝多糖治療糖尿病視網(wǎng)膜病變提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：鼠齡為6周的普通級Wsitar大鼠50只，雄性，200～250 g（動物合格證號：SYXK 黑 2006-033），由哈爾濱醫(yī)科大學動物中心提供。

1.1.2 試劑：RT-PCR試劑盒，大連德寶生物有限公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ），美國 Sigma 公司；牛膝多糖（achyranthes bidentata blume polysaccharides，ABPS）由牡丹江醫(yī)學院中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 造模及分組：隨機選取10只Wsitar大鼠作為正常對照組（A組），予基礎飼料。其余40只制作糖尿病大鼠模型：以高熱量飲食喂養(yǎng)8周后，尾靜脈注射 STZ（15 mg/kg），48 h后檢測空腹血糖，血糖在11.1～33.3 mmol/L（不含 33.3 mmol/L），且伴有糖耐量減退者即為造模成功。A組基礎飼料飼養(yǎng)8周后，注射與STZ（15 mg/kg）同體積的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。造模成功的40只大鼠隨機分為4組，每組10只：糖尿病模型組（B 組）、ABPS高劑量組（C 組）、ABPS中劑量組（D組）、ABPS低劑量組（E組）。造模成功后48 h，B組給予生理鹽水灌胃，C、D、E組給予不同劑量 ABPS 灌胃治療，給藥劑量分別為300mg·kg-1·d-1、200mg·kg-1·d-1和 100mg·kg-1·d-1。 給藥治療 12 周后，取材處死。

1.2.2 標本制作：10%水合氯醛0.3 ml/100 g左下腹腔注射使大鼠麻醉，迅速分離眼球，剪斷視神經(jīng)，摘除雙側眼球，迅速將眼球壁用針頭固定在冰臺上，在顯微鏡下取出雙眼視網(wǎng)膜，將同1只大鼠2眼視網(wǎng)膜合一，編號，置于-70℃冰箱保存，用于RT-PCR及DNA ladder檢測。

1.2.3 DNA ladder檢測視網(wǎng)膜組織細胞凋亡：取凍存視網(wǎng)膜組織磨成粉末，加50 μl細胞裂解液，37℃水浴過夜后，室溫下以12 000 r/min離心5 min，將上清液移至另一微量離心管。用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液（體積比25∶24∶1）和氯仿各抽提1次。在上清液中加入1/10體積3 mol/L的醋酸鈉和2倍體積的冷乙醇，-20℃沉淀過夜，4℃下以12 000 r/min離心10 min，棄上清液。晾干，加20 μl TE緩沖液，1 μl RNA 酶，37℃下放置 1 h，加 4 μl樣品緩沖液，混勻，加到1.8%的瓊脂糖凝膠樣品孔中，電壓2 V/cm，電泳 1～2 h。

1.2.4 RT-PCR測定視網(wǎng)膜組織survivin、bax mRNA表達：設計引物如下：survivin 引物，上游：5′-TTGGCAGGTGCCTGTTGAAT-3′； 下游：5′-AGCCAGTC CCCCACAGCAT-3′，擴增片段 329 bp。 bax 引物，上游：5′-GTTTCATCCAGGATCGAGC-3′；下游：5′-GGAAGTCCAATGTCCAGC-3′，擴增片段 345 bp。βactin 上游引物：5′-TTGCCTCTCAGACAATGCCTG-3；下游引物：5′-TCGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′，擴增片段280 bp。反應條件為：95℃預變性2 min，94℃45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，72℃復性5 min。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，分別計算survivin、bax 與內(nèi)參（β-actin）擴增帶熒光強度×面積的比值，得出survivin、bax mRNA的相對表達量。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般情況及癥狀比較

正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，體重逐漸增加，飲食、飲水量正常。模型組大鼠一般狀況較差，日益消瘦，生長發(fā)育遲緩，體毛無光澤，脫毛，活動頻度增加，但反應遲鈍，精神萎靡。造模4天即出現(xiàn)多飲、多食、尿量明顯增多。ABPS各組大鼠精神狀況、體重增長介于正常對照組和模型組之間，亦表現(xiàn)多飲、多食、多尿及消瘦的“三多一少”癥狀，后期經(jīng)藥物治療癥狀明顯緩解。

2.2 各組視網(wǎng)膜組織細胞凋亡情況

細胞發(fā)生凋亡后，電泳出現(xiàn)“梯狀”圖譜（ladder），與Marker相比，ladder中條帶的bp數(shù)為 180-200bp的整倍數(shù)。正常對照組：DNA電泳后只出現(xiàn)1條距加樣孔很近的大分子條帶，電泳無ladder出現(xiàn)，所以發(fā)生凋亡的細胞數(shù)非常少。糖尿病模型組：DNA電泳后出現(xiàn)排列成梯狀的數(shù)條條帶（ladder），ladder顏色較深，發(fā)生凋亡細胞數(shù)明顯增多。ABPS高、中劑量組：只出現(xiàn)1條距加樣孔很近的大分子條帶，電泳無ladder出現(xiàn)，發(fā)生凋亡的細胞數(shù)較少。ABPS低劑量組：出現(xiàn)較短的ladder，發(fā)生凋亡細胞數(shù)增多（圖 1）。

圖1 各組DNA ladder情況

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織bax、survivin表達

與糖尿病模型組比較，ABPS各組大鼠視網(wǎng)膜組織bax基因mRNA表達降低，survivin基因mRNA表達增加（P＜0.01）（表 1，圖 2、圖 3）。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織bax、survivin mRNA的表達情況（±s）

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織bax、survivin mRNA的表達情況（±s）

注：①與正常對照組比較，P＜0.01；②與模型組比較，P＜0.01。

組別 n bax/β-Actin survivin/β-Actin A 10 0.12±0.01 0.48±0.04 B 10 0.58±0.04① 0.25±0.01①C 10 0.24±0.02①② 0.40±0.03①②D 10 0.39±0.03①② 0.33±0.03①②E 10 0.46±0.03①② 0.30±0.02①②

圖2 各組細胞bax基因表達

圖3 各組細胞survivin基因表達

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，已有研究表明細胞凋亡與糖尿病視網(wǎng)膜病變密切相關。細胞凋亡是指有核細胞在生理條件下啟動自身的遺傳機制，主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生自動死亡的過程。bcl基因家族是重要的凋亡調(diào)控基因，包括抑凋亡基因bcl-2、bcl-xl和促凋亡基因如 bax、bak、bcl-xs等〔3〕。Bax 在多種細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Bax的促凋亡作用是通過與自身形成bax/bax同源二聚體的形式發(fā)揮的，Bax促進細胞凋亡的機制可能是與增高Caspase-3活性有關，Bax是 Caspase-3 活化的重要調(diào)節(jié)因子〔4〕。 Survivin 由 Altieri等〔5〕在 1997 年發(fā)現(xiàn)，是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中一個成員，具有抑制細胞凋亡、促進細胞轉化等作用，參與細胞的有絲分裂、血管的生成以及腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子。體外實驗表明，Survivin與效應細胞死亡蛋白酶Caspase-3和Caspase-7結合，抑制它們的活性和細胞凋亡〔6〕。

長期以來，一直認為視網(wǎng)膜細胞喪失是糖尿病最早的特征性改變，糖尿病視網(wǎng)膜細胞凋亡是糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的核心機制之一〔7〕。但糖尿病視網(wǎng)膜細胞凋亡的分子生物學機制并未闡明。本實驗發(fā)現(xiàn)ABPS具有抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織細胞凋亡的作用，高劑量組效果最明顯（P＜0.01）。為了進一步探討其阻止凋亡的分子機制，我們通過RT-PCR的方法檢測ABPS對視網(wǎng)膜細胞bax、survivin基因表達量的調(diào)節(jié)。實驗結果顯示ABPS能顯著下調(diào)bax基因表達，上調(diào)survivin基因表達，高劑量組效果最顯著（P＜0.01）。由此我們認為，ABPS通過調(diào)控bax、survivin基因表達，達到阻止糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用。

[1] 陳清華，劉祝英，賀建華.牛膝多糖對仔豬淋巴細胞增殖作用和細胞因子分泌量的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2008，20（6）：30-32.

[2] 鄭潔珍，周大興，顧靜.懷牛膝有效成分對血管平滑肌收縮作用的影響[J].安徽中醫(yī)學院學報，2008，27（54）：38-40.

[3] Nicholson DW，Thomberry NA.Apoptosis：Life and death decision[J].Science，2003，299（5604）：214-215.

[4] Cregan SP，Maclautin JG，Craig CG，et al.Bax-depentent caspase-3 activation is a key determinant in p53-induced apoptosis in neurons[J].J Neurosci，1999，19（18）：7860-7869.

[5] Ducken CS，Li F，Wang Y， et al.Human IAP-like protein regulates programmed cell death Downstream of Bcl-xl and cytochrome c[J].Mol Cell Biol，1998，18（1）：608-615.

[6] Suzuki A，Ito T，Kawano H，et al.Survivin initiates pricaspase3/p21 complex formation as a result of interaction with CDK4 to resist Fas mediate cell death[J].Oncogene，2000，19（10）：1346-l353.

[7] 劉學政，蕭 鴻，李永陽，等.早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細血管凋亡及其特征[J].眼視光學雜志，2001，3（3）：152-154.