欒兆倩 高健生 接傳紅 宋劍濤 嚴 京 吳正正 郭欣璐 陳子燕

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病嚴重的并發(fā)癥。新生血管形成是其重要病理變化之一。DR新生血管形成實質(zhì)上是細胞增殖失控的過程。其中起主要作用的細胞是內(nèi)皮細胞（endothelial cell，EC）。 血管內(nèi)皮生長因子 （vascular en dothelial growth factor，VEGF）是最直接的血管內(nèi)皮細胞促分裂素。它除了能促進內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管形成外，還具有提高血管通透性、改變細胞外基質(zhì)、上調(diào)細胞間粘附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表達〔1-4〕等功能。 在缺氧狀態(tài)下，VEGF的表達升高是由缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1α）調(diào)控的〔5，6〕。 隨著對HIF-1α及糖尿病視網(wǎng)膜病變的深入研究，認為它可能是糖尿病視網(wǎng)膜病變中最為關(guān)鍵的因子之一。密蒙花方是導(dǎo)師高健生研究員多年臨證總結(jié)的有效治療DR的經(jīng)驗方。本實驗擬從細胞分子水平探討該方對缺氧狀態(tài)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial，HUVEC）增殖及 HIF-1α 表達的影響，為尋求有效防治糖尿病視網(wǎng)膜新生血管的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物工程有限公司，胰蛋白酶、CoCl2購自美國Sigma公司，PBS購自北京中杉金橋科技有限公司，兔抗人HIF-1α多克隆抗體、即用型SABC免疫細胞化學(xué)染色試劑盒均購自北京博奧森生物工程有限公司。二氨基聯(lián)苯胺顯色劑（DAB）、蘇木素染色液均購自福州邁新生物工程有限公司。四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自美國Amresco公司。

1.1.2 細胞來源：人臍靜脈內(nèi)皮細胞株為中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗中心形態(tài)學(xué)實驗室饋贈。

1.1.3 中藥來源：中藥材購自北京燕北藥材公司，經(jīng)我院藥房鑒定為道地藥材。生黃芪（產(chǎn)于內(nèi)蒙古），女貞子、益母草（均產(chǎn)于河北），黃連（產(chǎn)于四川），肉桂（產(chǎn)于廣東），密蒙花（產(chǎn)于湖北），烏梅（產(chǎn)于浙江）。1.1.4 實驗儀器：倒置相差顯微鏡、圖像分析系統(tǒng)（奧林巴斯），二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Thermo），超凈工作臺（蘇州凈化），離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠），全自動酶標(biāo)儀（上海熱電儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 制備密蒙花方水提液：密蒙花方所含中藥材沸水浴煎半小時，過濾并收集濾液，取濾渣重復(fù)提取1次，合并二次濾液，加入2倍體積的90%乙醇溶液（V/V），4℃過夜，離心去除乙醇不溶成分，配成濃度為1 g/ml水提液。0.22 μm微孔濾膜濾過滅菌。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HUVEC的培養(yǎng)：取HUVEC細胞株，復(fù)蘇后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法，在37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)，待細胞長滿融合后按1∶3分瓶傳代。

1.2.3 實驗分組：每組設(shè)6個平行樣本：（1）正常組：RPMI1640維持液。（2）缺氧組：正常組+終濃度100 μmol/L CoCl2。 （3）密蒙花方低濃度組：缺氧組+10 mg/ml密蒙花方水提液。（4）密蒙花方中濃度組：缺氧組+20 mg/ml密蒙花方水提液。（5）密蒙花方高濃度組：缺氧組+40 mg/ml密蒙花方水提液。

1.2.4 MTT法檢測密蒙花方對缺氧狀態(tài)人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的影響：取生長良好的HUVEC，制成濃度為1.0×105/ml的HUVEC懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔 100 μl，37℃下 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，棄培養(yǎng)液，根據(jù)實驗分組，分別加入不同的藥物，每組設(shè)6個平行孔，每孔100 μl液體，37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時，棄培養(yǎng)液，每孔加入終濃度為 0.5 mg/ml的 MTT溶液 100 μl，37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中放置4小時，棄MTT溶液，每孔加200μl二甲亞砜（DMSO）溶液，振蕩10分鐘，于全自動酶標(biāo)儀上選490nm為測定波長，參考波長為630nm，比色測定各孔吸光度值（OD值）。

1.2.5 免疫細胞化學(xué)法檢測密蒙花方對缺氧狀態(tài)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HIF-1α表達的影響：將細胞接種于放有蓋玻片的24孔板中。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，按實驗分組，分別加入不同藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后從24孔板中分別取出各組蓋玻片，室溫下在多聚甲醛中固定。0.1%triton X-100破膜。30%H2O21份+純甲醇50份混合，室溫浸泡蓋玻片以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉。滴加一抗（兔抗人HIF-1α多克隆抗體，稀釋度為 1∶100）室溫過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃60分鐘。滴加辣根過氧化物酶工作液，37℃30分鐘（以上各步間均用PBS漂洗3次）。DAB顯色，蒸餾水洗滌。蘇木素復(fù)染。梯度酒精脫水。二甲苯透明。中性樹膠封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。用積分光密度表示HIF-1α的表達，通過圖象分析系統(tǒng)進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC細胞增殖的影響

不同濃度的密蒙花方（10 mg/ml，20 mg/ml，40 mg/ml）分別與 CoCl2共同作用于 HUVEC 24小時后，顯示出明顯的抑制HUVEC增殖的作用，并且呈濃度依賴關(guān)系（表1，圖1）。與正常組比較，缺氧組光度值（OD 值）升高（P＜0.01），顯示出明顯的促增殖作用；與缺氧組比較，各密蒙花方組OD值顯著降低（P＜0.01），均表現(xiàn)出較強的抑制增殖的作用，并且OD值隨著密蒙花方濃度的增高而逐漸降低（P＜0.01）。

表1 MTT法檢測密蒙花方對HUVEC增殖的影響（±s，n=6）

表1 MTT法檢測密蒙花方對HUVEC增殖的影響（±s，n=6）

注：①缺氧組與正常組相比P＜0.01；②密蒙花方低濃度組與缺氧組相比P＜0.05；密蒙花方中、高濃度組與缺氧組相比 P＜0.01；③密蒙花方各濃度組之間相比 P＜0.01。

組別 OD值 抑制率（%）正常組 0.363±0.018缺氧組 0.381±0.022①密蒙花方低濃度組 0.331±0.019②③ 13.11密蒙花方中濃度組 0.256±0.015②③ 32.95密蒙花方高濃度組 0.227±0.012②③ 40.42

圖1 MTT法檢測密蒙花方對HUVEC增殖的影響

2.2 密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC細胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達的影響

與正常組相比，缺氧組HIF-1α蛋白表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與缺氧組相比，各密蒙花方組HIF-1α蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（低、中濃度組 P＜0.05，高濃度組 P＜0.01）；各密蒙花方組組間比較，HIF-1α蛋白表達隨密蒙花方濃度升高而降低，密蒙花方高濃度組較中、低濃度組HIF-1α蛋白表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），中、低濃度組HIF-1α蛋白表達差異無統(tǒng)計意義（P＞0.05）（表 2，圖 2）。

表2 免疫細胞化學(xué)法檢測密蒙花方對HUVEC細胞內(nèi)HIF-1α 的影響（±s，n=6）

表2 免疫細胞化學(xué)法檢測密蒙花方對HUVEC細胞內(nèi)HIF-1α 的影響（±s，n=6）

注：①缺氧組與正常組相比 P＜0.01；②密蒙花方低、中濃度組與缺氧組相比P＜0.05；密蒙花方高濃度組與缺氧組相比P＜0.01；③密蒙花方高濃度組與中、低濃度組相比 P＜0.01。

組別 HIF-1α光密度值正常組 153696.942±64716.946缺氧組 546058.857±134355.000①密蒙花方低濃度組 446238.838±46492.153②③密蒙花方中濃度組 414345.585±69003.986②③密蒙花方高濃度組 308837.105±74998.959②③

3 討論

圖2 免疫細胞化學(xué)法顯示密蒙花方對缺氧狀態(tài)下HUVEC內(nèi)HIF-1α的影響（×40）。A正常組：胞漿內(nèi)HIF-1α僅呈微量表達。B缺氧組：胞漿內(nèi)HIF-1α強陽性表達，顯色呈深黃褐色。C密蒙花方低濃度組：胞漿內(nèi)HIF-1α表達較B組減弱，顯色呈淺黃褐色。D密蒙花方中濃度組：胞漿內(nèi)HIF-1α表達較B組減弱，顯色呈淺黃褐色，較C組變淺。E密蒙花方高濃度組：胞漿內(nèi)HIF-1α表達較B組減弱，顯色呈淡黃棕色。

血管生成是以微血管出芽的方式，從已存在的血管床長出，并形成新的血管分支及毛細血管叢，是已存在于血管內(nèi)的成熟的經(jīng)過充分分化了的內(nèi)皮細胞增殖、遷移和重塑的結(jié)果〔7〕。DR的新生血管即是以微血管出芽的方式，在原有的血管床、小靜脈和毛細血管的基礎(chǔ)上發(fā)生和發(fā)展的，但其血管組織結(jié)構(gòu)不完整，管壁通透性增加，容易發(fā)生滲漏和出血，產(chǎn)生各種并發(fā)癥。它的形成過程包括：基底膜被降解，內(nèi)皮細胞（EC）穿過基底膜遷移到血管周圍基質(zhì)，EC增殖、相互黏附并連接，內(nèi)皮細胞和周細胞相互作用，形成管腔樣結(jié)構(gòu)。新生血管本質(zhì)上是一種細胞增殖失控而導(dǎo)致的分子生物學(xué)過程。血管內(nèi)皮細胞在新生血管形成過程中起到主要作用，通過內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、分化和結(jié)構(gòu)重建構(gòu)成了新的毛細血管網(wǎng)。

HIF-1是維持氧自穩(wěn)平衡的核心調(diào)控因子，調(diào)控一系列缺氧相關(guān)基因的表達，而且在感受缺氧，傳遞缺氧信號的過程中發(fā)揮著重要作用。HIF-1由α亞基和β亞基組成。β亞基在細胞內(nèi)呈構(gòu)成性表達，不受細胞氧濃度的調(diào)節(jié)；α亞基在正常情況下經(jīng)翻譯后即迅速通過泛素-蛋白酶途徑被水解。α亞基564位脯氨酸殘基羥基化后，與VHL抑癌基因的產(chǎn)物相結(jié)合，HIF-1α亞基才能被降解，羥基化的完成依賴于環(huán)境中O2的濃度，及本身依賴氧的天冬酰氨羥化酶、脯氨酰羥化酶的調(diào)節(jié)和參與。所以HIF-1α蛋白的表達和轉(zhuǎn)錄主要受細胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)〔8-13〕。缺氧時脯氨酸殘基羥基化無法完成，導(dǎo)致泛素E3連接酶復(fù)合體無法形成，HIF-1α不能被泛素化降解，α亞基得以和β亞基結(jié)合形成有活性的HIF-1，HIF-1大量分泌。HIF-1被缺氧信號激活后，與VEGF 5′端增強子相互作用，調(diào)節(jié)VEGF表達升高，VEGF通過作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞上大量高親和力受體，促進血管內(nèi)皮細胞分裂、增殖，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管形成，以增加供氧，維持細胞和機體的氧自穩(wěn)平衡及能量代謝平衡。研究表明，通過siRNA抑制 HIF-1 表達后，VEGF mRNA 水平降低〔14〕。 HIF-1被激活后還能與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，調(diào)控一系列缺氧相關(guān)基因的表達，如促紅細胞生成素、糖酵解的酶類等，使缺氧誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄增強，引發(fā)一系列適應(yīng)缺氧的生理效應(yīng)〔15，16〕。 所以，HIF-1α 是血管生長信號途徑的關(guān)鍵上游轉(zhuǎn)錄因子。有可能通過操縱HIF-1α來控制HIF-1而調(diào)節(jié)全部的血管生成基因，從而控制新生血管的形成。

氯化鈷誘導(dǎo)細胞缺氧模型是一種較成熟的制造缺氧模型方法。Co2+是鐵螯合酶的底物，可替代氧感受器血紅素蛋白的Fe2+，Co2+在氧高濃度時才能與氧結(jié)合，使血紅素蛋白在正常氧濃度下不能與氧結(jié)合，故可將此分子鎖定在脫氧合狀態(tài)（根據(jù)血紅素蛋白的鐵離子是否與氧結(jié)合，分為氧合狀態(tài)和脫氧合狀態(tài)），模擬缺氧狀態(tài)。CoC12的作用機理與低氧一致，相當(dāng)于細胞氧感受器受到低氧刺激，考慮到CoCl2對細胞有損害作用，本實驗采用適當(dāng)劑量（100 μmol/L）CoCl2刺激，且作用24 h，成功模擬了內(nèi)皮細胞缺氧環(huán)境。

密蒙花方是在密蒙花、交泰丸（黃連、肉桂）的基礎(chǔ)上加黃芪、女貞子、烏梅、益母草而成。黃芪大補元氣，女貞子補肝腎明目為君藥，益母草和血利水明目，烏梅收斂生津止血為臣藥，黃連、肉桂相配使水火即濟，能安神寧血為佐藥，密蒙花清肝火除翳膜，可入血絡(luò)退赤脈，為使藥，而密蒙花又兼輕清之性，引藥上行，功用獨特，故本方以此藥命名。7味藥相配伍，共奏益氣滋陰，溫陽化氣，和血明目的功效。本課題組對該方進行了多中心臨床研究（國家科技部2005年度社會公益研究專項：“糖尿病視網(wǎng)膜病變早期預(yù)防和干預(yù)的研究”，項目編號：2005DIBIJ170），大量臨床病例證明，本方對DR具有一定的防治作用。

本實驗表明，在缺氧狀態(tài)下，HUVEC增殖明顯，細胞中HIF-1α表達增高，密蒙花方能有效的抑制細胞增殖及HIF-1α表達，并呈濃度依賴關(guān)系。密蒙花方可能通過抑制HIF-1α的表達而抑制VEGF的表達，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，對新生血管的形成起到一定的抑制作用。本研究為臨床上使用密蒙花方治療DR提供了科學(xué)的實驗依據(jù)，提示密蒙花方有可能成為抑制DR新生血管的有效藥物，但其具體作用機制還有待于進一步深入研究。

[1] Joussin Am，Poulaki V，Qin W，et al.Retinal vascular endothelial growth factor induces intercellular adhesion molecule-1 and endothelial nitric oxide syntheses expression and initiates early diabetic retinal leukocyte adhesion in vivo[J].Am J Pathol，2002，160（2）：501.

[2] Ozaki H，Seo MS，Ozaki K，et al.Blockaed of vascular endothelial cell growth factor receptor signaling is sufficient to completely prevent retinal neovascularization[J].Am J Pathol，2000，156（2）：697.

[3] Tang S，Le-Ruppert KC，Gabel VP.Eepress of intercellular adhesion molecule （ICAM-1） and Vascular cell adhesion molecule-1（VCAM-1）on proliferating vascular endothelial cells in diabetic epiretinal membranes[J].Br J Ophthalmol，1994，78（5）：370.

[4] 宋劍濤，吳 烈.糖尿病視網(wǎng)膜病變白細胞和粘附分子的研究進展[J].眼科，2004，13（1）：54-57.

[5] Jin KL，Mao XO，Nagayama T，et al.Induction of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1alpha by global ischemia in rat brain[J].Neuroscience，2000，99（3）：577-585.

[6] Richard DE，Berra E，Pouyssegur J.Angiogenesis：how a tμmor adapts to hypoxia[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，266（3）：718-722.

[7] Bdolah Y，Sukhatme VP，Karumanchi SA.Angiogenic imbalance in the pathophysiology of preeclampsia：newer insights[J].Semin Nephrol，2004，24（6）：548-556.

[8] Epstein AC，Gleadle JM，McNeill LA，et al.elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation[J].Cell，2001，107（1）：43-54.

[9] Ivan M，Kondo K，Yang H，et al.HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation：implications for O2sensing[J].Science，2001，292（5516）：464-468.

[10]Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science，2001，292（5516）：468-472.

[11]趙榮瑞.缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）的基礎(chǔ)研究與臨床意義[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，37（3）：225-230.

[12]朱 潔.鈣離子在缺氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞HIF-1活化和VEGF表達中的作用[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2005.

[13]Arjamaa O，Nikinmaa M.Oxygen-dependent diseases in the retina：role of hypoxia-inducible factors[J].Exp Eye Res，2006，83（3）：473-483.

[14]許惠卓，劉雙珍，夏曉波，等.低氧誘導(dǎo)因子-1α干擾RNA對血管內(nèi)皮生長因子mRNA表達的抑制作用[J].眼視光學(xué)雜志，2007，9（4）：228-231.

[15]Lando D，Peet DJ，Whelan DA，et al.Asparagine hydroxylation of the HIF transactivation domain a hypoxic switch[J].Science，2002，295（5556）：858-861.

[16]趙 煒.HIF-1α在缺氧誘導(dǎo)的體外脈絡(luò)膜新生血管生成中的調(diào)控作用[D].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)，2008.