李義龍,王 萌,唐志毅,韓靖云,黃桂玉

(衛(wèi)生部北京醫(yī)院 檢驗(yàn)科,北京100730)

游離脂肪酸(FFA)是由油酸、軟脂酸、亞油酸等組成,是甘油三酯的水解產(chǎn)物,大部分游離脂肪酸與血清白蛋白結(jié)合存在于血液中。血清中游離脂肪酸濃度受脂類代謝、糖代謝、內(nèi)分泌功能等的影響。近年來研究發(fā)現(xiàn)FFA水平升高即可增加胰島素抵抗又可引起高胰島素血癥[1]。大多數(shù)肥胖人群的2型糖尿病患者都存在胰島素抵抗,而血漿游離脂肪酸(FFA)是聯(lián)系肥胖和胰島素抵抗或高胰島素血癥的重要環(huán)節(jié)[2]。目前測(cè)定血清FFA有滴定法,比色法,原子分光光度法,高壓液相層析法,氣相色譜法和酶法等。由于傳統(tǒng)方法操作繁瑣且精密度差,而日本積水醫(yī)療株式會(huì)社最新研制的酶法檢測(cè)血清FFA試劑盒具有特異性高精密度好,操作簡(jiǎn)單并可直接用于自動(dòng)生化儀檢測(cè)。本文將FFA酶法試劑盒進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià),并對(duì)部分2型糖尿病患者進(jìn)行FFA檢測(cè),結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集北京醫(yī)院臨床血清標(biāo)本,按照FFA低、高2個(gè)水平制成混合血清,分裝后于-80℃儲(chǔ)存,用于不精密度測(cè)定;選擇FFA高值樣本用于線性分析。296例健康對(duì)照組:來自北京醫(yī)院健康體檢人員,男性164名,女性132名,用于參考范圍的建立。123例2型糖尿病組。

1.2 試劑與儀器 FFA酶法試劑盒、校準(zhǔn)物、質(zhì)控及干擾物均來自日本積水醫(yī)療株式會(huì)社。儀器為日本日立7170A型全自動(dòng)生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 酶法FFA的不精密度試驗(yàn) 參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒布的EP5-A文件方案[3]進(jìn)行操作。收集低高值2水平FFA混合血清。連續(xù)測(cè)定20天,每天測(cè)定兩批,批間間隔的時(shí)間不少于2小時(shí),每批對(duì)樣品做雙份測(cè)定,取均值,計(jì)算批內(nèi)、批間、天間及總不精密度(cv%)。

1.3.2 酶法FFA的回收試驗(yàn) (1)基礎(chǔ)樣本:向0.9 ml低濃度FFA血清樣本中加入0.9%NaCl溶液0.1 ml;(2)回收樣本:向0.9 ml低濃度FFA血清樣本中分別加入濃度為 250、500、1 000 μ Eq/L 的FFA標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.1 ml。混勻后重復(fù)檢測(cè)2次,計(jì)算均值。公式為:P=(X1-X0)/M×100%,其中P為回收率,X1為混合樣本的檢測(cè)平均值,X0為基礎(chǔ)標(biāo)本濃度,M為添加的標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

1.3.3 酶法FFA的干擾試驗(yàn) 參考NCCLS EP7-A2[4]文件方案進(jìn)行操作:在健康人混合血清中各自添加一定量的維生素C、膽紅素血紅蛋白、脂肪乳,同時(shí)測(cè)定這些標(biāo)本的FFA濃度,每個(gè)濃度測(cè)定2份,結(jié)果取均值,以干擾程度為10%作為該系統(tǒng)對(duì)干擾物的最高限。

1.3.4 最低檢測(cè)限試驗(yàn) 參照NCCLS EP17-A[5]評(píng)價(jià)方案,用1 ml蒸餾水為空白標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),一次連續(xù)測(cè)定20次,對(duì)于離群的可疑值采用G檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.5 線性范圍測(cè)定 參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)頒布的EP6-A[6]評(píng)價(jià)方案,用高濃度血清和低濃度血清,配置20個(gè)濃度梯度的溶液進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)濃度的標(biāo)本同時(shí)測(cè)定2次,計(jì)算平均濃度。

1.3.6 參考范圍設(shè)置 參照NCCLS C28-A2[7]評(píng)價(jià)方案,男性164名,女性132名,均為健康群體。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Microsoft Excel 2003,SPSS 11.0軟件?；貧w分析采用Passing-Bablok回歸,回歸線性檢測(cè)采用Cusum方法檢測(cè),P＜0.05表示線性回歸偏倚有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān),P＜0.05表示相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 結(jié)果

2.1 酶法FFA的不精密度試驗(yàn) 檢測(cè)低值和高值分別為486及981 μ Eq/L 2種濃度FFA血清的批間、批內(nèi)和總的CV見表1。CV的合格標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)量評(píng)估允許FFA誤差(25%)的1/4計(jì)算,因此CV應(yīng)＜6.25%。根據(jù)表1可以看出批內(nèi) 、批間、天間及總的CV 均 ＜6.25%,所以,酶法FFA試劑盒在檢測(cè)486至981 μ Eq/L濃度時(shí)精密度較好,總CV均小于5.0%。

2.2 酶法FFA試劑盒回收試驗(yàn) 經(jīng)計(jì)算3種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率分別為 98.0%、100.6%、103.7%,其回收率均在95%-105%范圍內(nèi),該方法的回收率良好。

表1 酶法測(cè)定FFA的不精密度

表2 酶法 FFA回收試驗(yàn)(μ Eq/L)

2.3 酶法FFA的干擾試驗(yàn) 較高濃度的維生素C、溶血素、膽紅素和乳糜對(duì)FFA測(cè)定值的干擾率均小于6%,即維生素C濃度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、膽紅素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%對(duì)FFA測(cè)定值均無明顯干擾 。

2.4 最低檢測(cè)限試驗(yàn) 測(cè)定FFA的最低檢測(cè)限為26.2 μ Eq/L 。

2.5 線性范圍測(cè)定 經(jīng)測(cè)定結(jié)果顯示Y=1.028X+12.2,R2=0.999 6,P＜0.05;R2=0.999 6說明檢測(cè)值與理論值的相關(guān)性較好;b=1.028在0.97-1.03之間,說明斜率接近1;a=12.2說明截距接近0;P＜0.05說明所有偏移為抽樣誤差,因此當(dāng)FFA濃度為35-1 780 μ Eq/L時(shí)線性良好,偏倚較小。

2.6 健康人群血清FFA參考范圍 男女兩組游離脂肪酸測(cè)定結(jié)果,分別經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以±s表示,男性游離脂肪酸水平為:FFA 401.1±158.6 μ Eq/L;女性游離脂肪酸水平為:FFA 446.5±165.6 μ Eq/L,男女兩組游離脂肪酸水平比較無顯著性差異。統(tǒng)計(jì)分析后到出FFA的參考范圍為96-740 μ Eq/L,與廠家提供的參考范圍129-769 μ Eq/L基本一致。男性與女性比較P＞0.05無顯著性差異。

2.7 FFA在2型糖尿病中的應(yīng)用價(jià)值 2型糖尿病(2 DM)患者及對(duì)照組的 GLU、FFA、TC、TG 、HDLC、LDL-C測(cè)定結(jié)果。2型糖尿病組GLU、FFA、TC、LDL和TG升高明顯,HDL降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間生化指標(biāo)具有顯著性差異(P＜0.01)。2型糖尿病組中的GLU 與 FFA、TC、TG、HDL、LDL的相關(guān)系數(shù)分別為0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相關(guān)系數(shù) r=0.23,顯著性水平為0.027,小于0.05,因此,GLU與FFA顯著相關(guān)。而與其它生化指標(biāo)的顯著性水平均大于0.05,與GLU的相關(guān)性不顯著。由于在2型糖尿病組中的GLU與FFA具有顯著相關(guān),FFA極有可能是反映胰島素抵抗的敏感指標(biāo)。

3 討論

游離脂肪酸(FFA)代謝正常與否在2型糖尿病糖代謝異常的發(fā)生、發(fā)展中起了十分重要的作用[1]。2型糖尿病的另一主要發(fā)病機(jī)制是胰島β細(xì)胞分泌胰島素的缺陷。高水平的FFA可以直接損害胰島β細(xì)胞,最終發(fā)生與2型糖尿病相似的β細(xì)胞功能異常[8]。正確認(rèn)識(shí)超重/肥胖患者胰島素抵抗和β細(xì)胞功能異常的不同階段中血清FFA水平的差異,有助于更好地理解FFA在疾病進(jìn)展過程中所起作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肥胖人群都存在胰島素抵抗,而血漿游離脂肪酸(FFA)是聯(lián)系肥胖和胰島素抵抗或高胰島素血癥的重要環(huán)節(jié)。肥胖的一個(gè)顯著病理學(xué)特征就是脂肪細(xì)胞和脂肪組織體積增大。糾正FFA代謝異常對(duì)肥胖和2型糖尿病的防治有十分重要的意義[9]。

本文參照NCCLS EP文件對(duì)日本積水醫(yī)療FFA試劑盒進(jìn)行精密度、線性范圍、檢測(cè)限、干擾及回收試驗(yàn)評(píng)估均取得良好的成績(jī)。FFA分別為486及981 μ Eq/L 2種濃度的總CV均小于5.0%,最低檢測(cè)限為26.2 μ Eq/L因此當(dāng)FFA濃度為35-1 780 μ Eq/L時(shí)線性良好,偏倚較小。此試劑盒回收率較高均在95%-105%范圍內(nèi)并具有較高的抗干擾能力,維生素C濃度＜500 mg/L、溶血素＜5 000 mg/L、膽紅素＜400 mg/L和乳糜＜2.0%對(duì)FFA測(cè)定值均無明顯干擾。對(duì)296名健康查體人群血清的FFA分布作了研究,結(jié)果顯示FFA的參考區(qū)間無性別差異參考區(qū)間為96-740 μ Eq/L。目前由于檢測(cè)血清FFA方法大多都不成熟,存在許多缺陷,其參考方法為高效液相質(zhì)譜法,此方法需昂貴的儀器和復(fù)雜的操作,由于實(shí)驗(yàn)室條件限制,故在方法學(xué)研究中未進(jìn)行與其他方法比對(duì),只是對(duì)FFA試劑盒的特性進(jìn)行評(píng)價(jià),包括不精密度、準(zhǔn)確性、線性及抗干擾等可完全滿足臨床需要。本文對(duì)123例2型糖尿病人的部分血脂項(xiàng)目進(jìn)行分析并與正常人作對(duì)照發(fā)現(xiàn)2型糖尿病人組的 GLU、FFA、TC、LDL-C和 TG升高明顯,HDL-C降低,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩組間生化指標(biāo)具有顯著性差異(P＜0.01)。2型糖尿病組中的GLU與FFA、TC、TG、HDL、LDL的相關(guān)系數(shù)分別為 0.23,0.14,0.06,0.06,0.18。GLU和FFA的相關(guān)系數(shù)r=0.23,顯著性水平為0.027,P＜0.05,因此,GLU與FFA顯著相關(guān)。而與其它生化指標(biāo)的顯著性水平均大于0.05,與GLU的相關(guān)性不顯著?？梢?型糖尿病組中的GLU與FFA具有顯著相關(guān)。另外,FFA測(cè)定一定要注意盡快分離血清并及時(shí)進(jìn)行檢測(cè),因血中含有各種脂肪酶存在,極易使TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA,使血中FFA值升高。貯存標(biāo)本僅限于24 h內(nèi),若保存三天,其值約升高30%,血清于-80℃可保存3個(gè)月。

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