胡嘯玲,湯恢煥*,徐海帆

(1.中南大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院普通外科,湖南長沙410008;2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科)

P53上調(diào)凋亡調(diào)控因子(PUMA)可以通過P53依賴途徑及其他促凋亡途經(jīng)促進細胞凋亡,在腫瘤的發(fā)生過程中及治療中發(fā)揮著重要作用[1-3]。C-myb是一種核內(nèi)癌基因,在多種類型細胞包括惡性腫瘤細胞增殖分化過程中起極其重要作用[4];其表達水平與一些惡性腫瘤發(fā)生、進展、臨床生物學(xué)行為及預(yù)后密切相關(guān)[8-13]。作者應(yīng)用免疫組化法研究結(jié)腸癌及其癌旁組織中PUMA和C-myb表達水平及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 標本分組及臨床病理資料

收集本院2001年1月至2002年12月結(jié)腸癌手術(shù)切除標本 54例。男性26例(48.2%),女性28(51.8%);年齡范圍24歲-82歲,平均(59.80±13.67)歲,其中≤50歲13例(24.1%)和＞50歲 41例(75.9%)。病理類型均為腺癌,其中高分化腺癌26例(48.2%),中分化腺癌15例(27.8%),低分化腺癌7例(13.0%),黏液腺癌6例(11.1%)。癌細胞侵襲深度包括粘膜下層3例(5.6%)、至深肌層20例(37.0%)和至漿膜層或漿膜外31例(57.4%)。共有 19例發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(35.2%),8例(14.8%)發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移(均為肝臟)。Dukes分期A+B 21例(38.9%)和C+D 33例(61.1%)。另收集以上結(jié)腸癌中癌旁非癌組織(距癌組織≥5 cm)30例,病理證實正常組織15例(50.0%)、輕度不典型增生7例(23.3%)、中度不典型增生5例(16.7%)和重度不典型增生3例(10.0%)。以上標本均經(jīng)4%甲醛固定后常規(guī)制作石蠟包埋切片,切片厚4 μ m。

1.2 主要試劑

兔抗人PUMA多克隆抗體及鼠抗人C-myb單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;EnVisionTM染色試劑盒購自瑞士DAKO公司。

1.3 方法

PUMA和C-myb染色方法均為免疫組化二步法,按試劑盒說明書操作。

免疫組化評分按二級計分法,首先按染色強度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;然后按陽性細胞率評分:腫瘤細胞內(nèi)無陽性染色者為0分,陽性細胞率≤10%為1分,11%-50%為2分,51%-75%為3分,＞75%為4分,將二者相加得綜合免疫組化評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

將所有實驗數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0統(tǒng)計軟件包,PUMA或C-myb表達陽性率與組織學(xué)或臨床因素的相互關(guān)系應(yīng)用 χ2檢驗或Fisher's精確概率法;兩者評分之間比較用t檢驗;三者評分之間比較用F檢驗。檢驗水準以P＜0.05被認為有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌和癌旁組織的PUMA和C-myb表達情況

PUMA免疫組化陽性產(chǎn)物主要定位于細胞膜和細胞漿(圖1,2);C-myb免疫組化陽性產(chǎn)物主要定位于細胞核,偶見定位于胞漿(圖3,4)。54例結(jié)腸腺癌PUMA和 C-my表達陽性病例分別為 35例(64.8%)和32例(59.3%),其評分值分別為2.38±1.42和2.21±1.74;30例癌旁組織PUMA和C-my表達陽性病例分別為5例(16.7%)和4例(13.3%),其評分值分別為0.48±0.69和0.46±0.74;結(jié)腸癌PUMA和C-my表達陽性率及其評分明顯高于癌旁組織(PUMA:χ2=17.92,t=7.04,P=0.000;C-myb:χ2=16.61,t=5.30,P=0.000)。PUMA和(或)C-myb表達陽性的癌旁組織呈輕至重度不典型增生。

2.2 PUMA和C-myb表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移及未侵犯漿膜層及Dukes分期A+B病例PUMA和C-myb表達陽性率及其評分明顯低于低分化腺癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯漿膜層及Dukes分期C+D病例,均有顯著或高度顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01);高分化腺癌PUMA表達陽性率及其評分明顯低于低分化腺癌(P＜0.05);PUMA和C-myb表達與結(jié)腸癌患者年齡、性別、部位及腫塊大小無明顯關(guān)系(P＞0.05),見表1。

圖1 PUMA陽性表達,評分4分,高分化腺癌,免疫組織化學(xué)×200

圖2 PUMA陽性表達,評分3分,輕度不典型增生的癌旁組織,免疫組織化學(xué)×200

圖3 C-myb陽性表達,評分5分,低分化腺癌,免疫組織化學(xué)×200

圖4 C-myb陽性表達,評分3分,中度不典型增生的癌旁組織,免疫組織化學(xué)×200

2.3 PUMA和C-myb在結(jié)腸癌中表達的相互關(guān)系

35例PUMA表達陽性病例中C-myb陽性表達28例,19例PUMA表達陰性病例中C-myb表達陰性15例,兩者表達呈明顯一致性(χ2=17.72,P=0.000);PUMA和C-my評分值之間呈高度正相關(guān)(r=0.59,P=0.000)。

3 討論

PUMA基因定位于19q,其cDNA長119 kb,它編碼一個193個氨基酸的蛋白質(zhì),它包含一個Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(BH3),這個結(jié)構(gòu)域在Bcl-2家族中的許多凋亡因子中都存在,除BH3結(jié)構(gòu)域外不存在其他與已知蛋白同源的區(qū)域,缺失BH3結(jié)構(gòu)域的PUMA不具備促凋亡作用。PUMA不但對正常細胞誘導(dǎo)凋亡,對腫瘤細胞也有重要作用,體外實驗證實PUMA能強烈誘導(dǎo)肺癌和食管癌細胞凋亡,抑制頭頸腫瘤細胞系的生長和集落形成能力,裸鼠移植瘤實驗證實PUMA能抑制腫瘤生長的作用[3]。

表1 PUMA和C-my表達評分與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

C-myb是一種核內(nèi)癌基因,位于人類6號染色體長臂24區(qū)帶,其編碼的蛋白質(zhì)為80 kd。早在80年代末國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)C-myb在細胞增殖分化過程中起著十分重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)C-myb在許多惡性腫瘤組織中(乳腺癌,直腸腺癌,肝細胞癌,食道腺癌,宮頸癌,頭頸鱗癌等)高表達,而其來源的正常組織或良性病變低表達或不表達;高表達的惡性腫瘤多分化差、進展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)、侵襲能力強及預(yù)后差[4-7];且應(yīng)用C-myb反義寡核苷酸可抑制一些惡性腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移及侵襲能力[5,7]。

國內(nèi)外關(guān)于結(jié)腸良惡性病變組織中PUMA和C-myb表達研究的文獻報道極少。本組資料顯示,結(jié)腸癌PUMA和C-myb表達陽性率及其評分均明顯高于癌旁組織(P＜0.01);PUMA和(或)C-myb陽性表達的良性病變結(jié)腸上皮呈中度至重度不典型增生。淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移、未侵犯漿膜或漿膜外組織器官及Dukes分期A+B病例PUMA和C-myb表達陽性率及其評分明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵犯漿膜或漿膜外周圍組織及Dukes分期C+D病例(P＜0.05或P＜0.01);高分化腺癌PUMA表達陽性率及其評分明顯低于低分化腺癌(P＜0.05);結(jié)腸癌中PUMA和C-myb表達水平呈正相關(guān)(r=0.59,P=0.000)。結(jié)果提示PUMA和C-myb表達水平可能是反映結(jié)腸腺癌發(fā)生、進展及臨床生物學(xué)行為的重要標記物,其陽性表達者進展快,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,侵襲能力強。檢測結(jié)腸良性病變組織中PUMA和(或)C-myb表達水平對預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腺癌可能有較重要的臨床意義。此外,本組資料顯示,在結(jié)腸腺癌中PUMA和C-myb表達水平呈一致性及兩者評分值之間呈高度正相關(guān),說明兩者之間存在著密切的內(nèi)在關(guān)系,其機制仍需更深入研究。

[1]Yee KS,Wikinson S,James J,et al.PUMA-and Bax-induced autophagy contributes to apoptosis[J].Cell Death Differ,2009,16(8):1135.

[2]Sinicrope FA,Rego RL,Okumura K,et al.Prognostic impact of bin,puma,and noxa expression in human colon carcinomas[J].Clin Cancer Res,2008,14(18):5810.

[3]Diallo JS,Aldejmah A,Mouhim AF,Et al.NoXA and PUMA expression add to clinical markers in predicting biochemical recurrence of prostate cancer patients in a survival tree model[J].Clin Cancer Res,2007,13(23):7044.

[4]RansayRG,Gonda TJ.MYB function in normal and cancer cells[J].Nat Rev Cancer,2008,8(7):523.

[5]Gonda TJ,Leo P,Ramsay RG.Estrogen and MYB in breast cancer.:potential for new therapies[J].Expert Opin Biol Ther,2008,8(6):713.

[6]Wilkins HR,Doucet K,Duke V,et al.Estrogen prevents sustained COLO-205 human colon cancer cell growth by inducing apoptosis,decreasing C-myb protein,and decreasing transcription of the anti-apoptosis protein bcl-2[J].Tumor Biol,2010,31(1):16.

[7]Kim SY,Yang YS,Hong KH,et al.Adenovirus-mediated expression of dominant negative c-myb induces apoptosis in head and neck cancer cells and inhibits tumor growth inanimal model[J].Oral Oncol,2008,44(4):383.