李 敏,鄧海峰,陸明洋,徐 斌,鄭 曉,劉 檢,吳 駿,季 枚,周 怡,孫 青,吳昌平,蔣敬庭

(蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤生物診療中心,江蘇常州213003)

腫瘤局部存在多種類型的免疫抑制性細(xì)胞,它參與腫瘤患者的細(xì)胞免疫與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中 CD4+CD25+T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)是一類具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)功能的T淋巴細(xì)胞亞群,一般占人外周血CD4+T細(xì)胞的5%-10%[1,2]。近年來,國內(nèi)外對這類調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究已從自身免疫耐受、移植免疫逐漸擴(kuò)展到腫瘤免疫,認(rèn)為CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞是形成腫瘤免疫耐受的關(guān)鍵成分[3]。由細(xì)胞因子激活的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)是可直接殺傷腫瘤細(xì)胞的一類新型抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞,并且可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。本課題組曾系列報(bào)道了胃癌患者采用化療聯(lián)合CIK細(xì)胞治療后機(jī)體的腫瘤標(biāo)志物水平、細(xì)胞免疫功能變化、近期療效觀察及副反應(yīng)等[4-8]。

我們利用流式細(xì)胞儀檢測了28例腫瘤患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的表達(dá),分析腫瘤的發(fā)生與CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞表達(dá)的關(guān)系,評價CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在腫瘤的免疫抑制方面所起的作用。同時觀察經(jīng)CIK治療后患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)型T細(xì)胞表達(dá)的變化,為評估CIK細(xì)胞治療及尋求新的免疫治療途徑提供思路。

1 材料與方法

1.1 研究對象 臨床確診的中晚期腫瘤患者28例(腫瘤組),胃癌18例,結(jié)腸癌4例,原發(fā)性肝癌4例,乳腺癌 2例。男20例,女8例;平均年齡(60±9)歲。CIK治療一個療程后3個月采外周血檢測。選擇健康成年人30例為對照,男15例,女15例,平均年齡(51±10)歲。

1.2 儀器及主要試劑 流式細(xì)胞儀EPICS XL(美國貝克曼庫爾特公司),鼠抗人單克隆抗體CD4-PE,CD25-PC5,CD3FITC/CD56-PE,CD3-FITC/CD8PE及IgG1同型對照抗體(蘇州基因生物技術(shù)有限公司)?；蛑亟M人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)(山東泉港藥業(yè)有限公司);基因重組γ干擾素(IFN-γ)(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司);淋巴細(xì)胞分離液(上海試劑二廠);RPMI 1640(美國GIBCO公司)。

1.3 CIK細(xì)胞的制備及回輸 分離外周血PBMC用含 10%人AB血清、25 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640調(diào)至起始密度2.0×106/L。于第 0天加入 1 000 U/ml γ-IFN,置于 37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24 h后加入rhIL-1α 100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml繼續(xù)培養(yǎng)。以后根據(jù)培養(yǎng)情況添加含 rhIL-1α100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml的RPMI1640完全培養(yǎng)液,并調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。CIK細(xì)胞培養(yǎng)至14-28天,取少許培養(yǎng)細(xì)胞做流式細(xì)胞儀檢測,當(dāng)CD3+CD56+細(xì)胞數(shù)≥50%,CD3+CD8+細(xì)胞≥30%且細(xì)菌及真菌培養(yǎng)陰性時即收集細(xì)胞。經(jīng)生理鹽水洗滌3次,加入1%人血白蛋白生理鹽水中回輸。一般為隔天回輸一次,一個療程共回輸5次,回輸細(xì)胞總數(shù)為1.6×1010以上。

1.4 FCM標(biāo)本的制備及檢測 取肝素抗凝外周血100 μ l,分別加入熒光標(biāo)記的抗體各 10 μ l,4℃避光孵育30 min,加入溶血素 500 μ l混勻,室溫溶血15 min,離心棄上清后各加入2 ml PBS洗滌2遍,最后加入500 μ l PBS混勻,10 min后上機(jī)檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。各組檢測結(jié)果以±s表示,組間差別采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性分析,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組與正常對照組外周血 CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)流式分析 分別為(9.30±2.99)和(6.43±2.45)均明顯高于正常對照組(5.01±1.69)(P＜0.05)。見圖1。

圖1 流式細(xì)胞檢測CIK治療前后腫瘤組與對照組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)

2.2 腫瘤患者在 CIK治療前及治療后其外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá) CIK治療前后腫瘤患者CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)分析如表1所示,CIK治療后患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)明顯低于治療前,其差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

CIK治療前后腫瘤患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)變化與患者性別無關(guān);治療前年齡較低(41-60)組患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)低于年齡較高(61-80)組,而治療后兩年齡組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 CIK治療前后腫瘤組與對照組外周血CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)測定

3 討論

Treg在體內(nèi)具有很強(qiáng)的免疫抑制作用,清除腫瘤患者體內(nèi)的Treg有望改善患者的免疫功能。大量研究表明,在眾多腫瘤患者外周血淋巴細(xì)胞中均有CD4+CD25+T細(xì)胞增多[9]。CD4+CD25+T細(xì)胞能夠通過CTLA-4依賴的直接細(xì)胞接觸抑制方式和分泌抑制性細(xì)胞因子如TGF-β或IL-10來抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖及分泌IL-2的能力[10,11]。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞亞群是機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答過程中的主要效應(yīng)細(xì)胞,因此CD4+CD25+T細(xì)胞的免疫抑制功能導(dǎo)致腫瘤局部或循環(huán)中T細(xì)胞功能紊亂從而抑制了腫瘤患者的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答。由此可以認(rèn)為CD4+CD25+T細(xì)胞比例增加成為導(dǎo)致腫瘤患者細(xì)胞免疫功能削弱的機(jī)制之一。

研究表明,移植白血病細(xì)胞之前輸入去除CD25+T細(xì)胞的脾細(xì)胞懸液,大多數(shù)BALB/C裸鼠生長腫瘤在一月內(nèi)自行消退,并且能長期生存。在第二次大劑量移植白血病細(xì)胞后,該裸鼠排斥腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)更快更激烈,說明它們產(chǎn)生了腫瘤特異性CTL。Steitz等研究發(fā)現(xiàn),在體內(nèi)去除CD25+T細(xì)胞可產(chǎn)生兩種效應(yīng)細(xì)胞,一種為CD8+CTL,其作用是抗原特異性的;另一種是CD4-CD8+T細(xì)胞,如NK細(xì)胞,無須抗原刺激而起作用,共同激發(fā)有效的腫瘤免疫。與此相似,在體外無瘤刺激環(huán)境中培養(yǎng)去除CD4+CD25+T細(xì)胞的脾細(xì)胞懸液,也能誘導(dǎo)上述兩種細(xì)胞的產(chǎn)生。在B16黑色素瘤小鼠中,通過抗CD4抗體,去除CD4+T細(xì)胞可使腫瘤生長遲緩,由此可以推測CD4+CD25+T細(xì)胞比例的升高可能是腫瘤特異性免疫下調(diào)的關(guān)鍵。

CIK細(xì)胞是人外周血單個核細(xì)胞在體外經(jīng)多種細(xì)胞因子刺激后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞,它具有增殖能力強(qiáng)、殺瘤活性高和殺瘤譜廣、臨床應(yīng)用副作用小的特點(diǎn),是腫瘤過繼免疫治療中更為有效的殺瘤效應(yīng)細(xì)胞。CIK細(xì)胞是一種非MHC(組織相容性抗原)和非T細(xì)胞受體限制性的免疫活性細(xì)胞,其主要效應(yīng)細(xì)胞為CD3+CD56+細(xì)胞。為進(jìn)一步了解腫瘤患者的免疫功能以及CIK細(xì)胞治療對腫瘤患者免疫功能的影響,本研究對28例腫瘤患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療前后,其外周血CD4+CD25+T細(xì)胞比例進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:相對于健康者,腫瘤患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)率顯著增高。這一結(jié)果表明,在腫瘤患者中CD4+CD25+T細(xì)胞發(fā)揮了免疫抑制作用,從而使機(jī)體不能很好發(fā)揮抗腫瘤免疫應(yīng)答作用,這在一定程度上進(jìn)一步加速了腫瘤的發(fā)展。在經(jīng)過CIK細(xì)胞治療后,腫瘤患者外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞比例較治療前明顯降低,但仍高于健康者。由此可見,CIK細(xì)胞治療可以在一定程度上提高患者的免疫功能。但是,盡管治療后患者的細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)得到了一定程度的解除,免疫功能逐步得到改善,機(jī)體處于一種活躍的免疫狀態(tài)中,但患者的免疫狀態(tài)仍然低下。因此,如何在更大程度上消除CD4+CD25+T細(xì)胞對患者免疫功能抑制的影響,成為腫瘤生物治療中一個需要重點(diǎn)解決的問題。

總之,隨著對CD4+CD25+T細(xì)胞研究的進(jìn)一步深入,通過特異性或非特異性清除Treg、控制Treg的數(shù)量和功能等開展腫瘤免疫治療必將為腫瘤免疫治療提供更多的策略。

作者簡是:李敏,女,33歲,碩士,助理研究員,研究方向:腫瘤生物治療。

[1]Woo E Y,Chu C S,Goletz T J,et al.Regulatory CD4(+)CD25(+)T cells in tumors from patients with early-stage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer[J].Cancer Res,2001,61:4766.

[2]Wolf A M,Wolf D,Steurer M,et al.Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients[J].Clin Cancer Res,2003,9:606.

[3]Apostolou I,von BoehmerH.In vivo instruction of suppressor commitment in naive T cells[J].J ExpMed,2004,199:1401.

[4]Jiang J,Xu N,Wu C,et al.Treatment of advanced gastric cancer by chemotherapy combined with autologous cytokine-induced killer cells[J].Anticancer Res,2006,26:2237.

[5]Jingting Jiang,Changping Wu,Liangrong Shi,et al.Side effects during treatment of advanced gastric carcinoma by chemotherapy combined with CIK-cell transfusion in elderly people[J].Clin Oncol Cancer Res,2008,5:79.

[6]王 琦,蔣敬庭,鄧海峰,et al.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療中晚期胃癌的療效[J].江蘇醫(yī)藥雜志,2007,33:800.

[7]蔣敬庭,吳昌平,沈月平,et al.細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療胃癌次數(shù)與患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究[J].中華消化雜志,2009,29:557.

[8]蔣敬庭,吳昌平,沈月平,et al.共刺激分子B7-H4表達(dá)對胃癌患者細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療預(yù)后的影響[J].中華胃腸外科雜志,2010,13:366.

[9]Ichihara F,Kono K,Takahashi A,et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers[J].Clin Cancer Res,2003,9:4404.

[10]Jonuleit H,Schmitt E,Kakirman H,et al.Infectious tolerance:human CD25(+)regulatory T cells convey suppressor activity to conventional CD4(+)T helper cells[J].J Exp Med,2002,196:255.

[11]Antony P A,Piccirillo C A,Akpinarli A,et al.CD8+T cell immunity against a tumor/self-antigen is augmented by CD4+T helper cells and hindered by naturally occurring T regulatory cells[J].J Immunol,2005,174:2591.