李桂榮,周鴻雁,張文松*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科醫(yī)院,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院眼科)

近年來,熱休克蛋白(heat shock protein,HSPs)對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用以及在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)方面受到了廣泛的關(guān)注。但在晶狀體中的研究較少。我們利用RT-PCR方法觀察了HSPs的兩種類型:HSP70和HSP27基因在老年性白內(nèi)障和正常人晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況,以探討這兩個(gè)基因與老年性白內(nèi)障發(fā)生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)組為北京朝陽(yáng)醫(yī)院2005年老年性白內(nèi)障患者晶狀體的前囊膜,共42眼(男26眼,女16眼)均為不同年齡的老年性白內(nèi)障,平均年齡63.4歲±8.2歲,實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組為健康成年眼球晶狀體的前囊膜,共15例,為青壯年。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、dNTPs(10 mM)、Taq 酶(2 U/μ l)、β-Actin(25 pmol/μ l)。均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

1.1.3 引物 從PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人HSP70、HSP27基因全序列,β-actin序列作為內(nèi)參照。應(yīng)用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。

引物由北京奧科生物公司合成。序列如下:HSP70 上 游 引 物 :5′-GTACAGAAAGACATTAAAAAT-3′,下 游 引 物 :5′-TCAGGGTCGAATAAAGTTACT-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 200 bp。HSP27上游引物:5′-GCGAATTCCCTGCTAAAAATACCCGACT-3′;下 游引 物 :5′-GCAGCTGGATGCCCACCCCTGC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 295 bp。 β-actin 上 游 引 物:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′;下 游 引 物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為506 bp。

1.2 方法

提取兩組晶狀體前囊膜中總RNA,并以此逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

以β-actin作為內(nèi)參,將其與待測(cè)得目的基因同時(shí)擴(kuò)增,分兩管相同體系進(jìn)行。按PCR試劑盒說明書操作。

瓊脂糖電泳分別取兩管反應(yīng)管中5 μ l擴(kuò)增產(chǎn)物和上樣緩沖液0.3 μ l點(diǎn)樣后90 V電泳1 h,凝膠用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察,并進(jìn)行半定量分析。圖像分析儀測(cè)照片上擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,計(jì)算出其基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參β-actin表達(dá)量的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組兩兩比較采用方差分析,取P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HSP27mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)情況

HSP27mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)如圖1所示,HSP27基因和內(nèi)參β-actin分別擴(kuò)增基因片段。1-5為老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞的HSP27基因的擴(kuò)增產(chǎn)物,6-7為正常對(duì)照的晶狀體上皮細(xì)胞的HSP27基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。老年性白內(nèi)障中HSP27基因擴(kuò)增的產(chǎn)物為295 bp,β-actin擴(kuò)增的產(chǎn)為506 bp。圖像分析儀測(cè)瓊脂糖凝膠上HSP27/β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,其基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的β-actin表達(dá)量的比值,老年性白內(nèi)障組為0.418±0.275,正常晶狀體前囊膜組為0.147±0.006,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

圖1 HSP27mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)情況

2.2 HSP70mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)情況

HSP70mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)如圖2所示,1-2為老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞的HSP70基因的擴(kuò)增產(chǎn)物,3-5為正常對(duì)照的晶狀體上皮細(xì)胞的HSP70基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。老年性白內(nèi)障中HSP70基因擴(kuò)增的產(chǎn)物為200bp,βactin擴(kuò)增的產(chǎn)為506 bp。圖像分析儀測(cè)瓊脂糖凝膠上HSP70/β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物的平均灰度,其基因表達(dá)量與其對(duì)應(yīng)的β-actin表達(dá)量的比值,老年性白內(nèi)障組為0.80±0.14,正常晶狀體前囊膜組為0.38±0.01,兩組比較差異有顯著性(P＜0.01)。

圖2 HSP70mRNA在老年性白內(nèi)障與正常對(duì)照的LECs的表達(dá)情況

3 討論

近年來的研究表明,晶狀體能表達(dá)一系列的熱休克蛋白(HSPs)。它們對(duì)維持晶狀體的穩(wěn)定和透明起到關(guān)鍵作用[1]。其中HSP70,HSP27與白內(nèi)障關(guān)系最為密切。

HSP70在正常細(xì)胞中水平較低,而在應(yīng)激后表達(dá)顯著增高。Li等研究顯示HSP70通過抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放及Caspase-3的活化而抑制細(xì)胞凋亡[2]。Dean等[3]的研究認(rèn)為,正常的生理環(huán)境,例如光照等,對(duì)于晶狀體來說亦是一種特殊的應(yīng)激狀態(tài),可以誘導(dǎo)HSP的產(chǎn)生。HSP 70的表達(dá)增加有利于晶狀體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象,維持晶狀體的透明性,延緩和減輕白內(nèi)障的發(fā)生。

HSP27是小分子熱休克蛋白家族中重要的一員,廣泛存在于人類細(xì)胞中,對(duì)維持晶狀體的透明性有重要意義。其功能主要表現(xiàn)在分子伴侶功能:阻止蛋白間不必要的相互作用;幫助變性蛋白重新折疊[4]。此外,對(duì)損傷細(xì)胞具有修復(fù)及保護(hù)作用[5],通過Fas/APO1受體參與細(xì)胞凋亡[6]。近年來,HSP27在晶狀體中的研究日益受到重視。Hawse等[7]在鎘、銅等有害金屬的作用下,應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)熱休克蛋白基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞的α-B晶體蛋白,HSP27等小分子熱休克蛋白表達(dá)增高,推論HSP27對(duì)金屬誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)具有細(xì)胞保護(hù)的作用。

老年性白內(nèi)障是最為常見的白內(nèi)障類型,多見于50歲以上的中老年人,隨年齡的增加其發(fā)病率升高。它是晶狀體老化后的退行性變,是多種因素作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)研究了42例老年性白內(nèi)障患者與15例正常對(duì)照眼,其晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)了HSP的表達(dá),但其表達(dá)量不同。老年性白內(nèi)障患者HSP27、HSP70mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組高,且兩者之間的差異達(dá)到了顯著水平(P＜0.05)。通過本研究,可以得出,HSP27、HSP70在老年性白內(nèi)障的發(fā)生和發(fā)展中起了重要的作用,為老年性白內(nèi)障的預(yù)防與臨床治療提供了理論依據(jù)。

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