孫啟玉,李 劍,韓迎春,薛承巖,關(guān)會臻,謝守軍,張茉莉,張秀琴*

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.普外科,河北 承德067000;2.隆化縣醫(yī)院 放射科)

吸煙對男性生殖能力的影響,特別是對精液質(zhì)量的影響,近年來已引起社會的廣泛關(guān)注。我們選擇在我院就診不孕患者及健康成年男性作為研究對象,對其精漿活性氧及精子凋亡率進(jìn)行檢測,以探索吸煙影響精液質(zhì)量的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

120例男性不育患者為2006年9月至2009年7月來我院就診病例,均為婚后2年以上,未采取任何避孕措施,性生活正常,排除女方不孕原因的不育男性,身體健康,無大量飲酒和長期接觸有害物質(zhì)史,無生殖道感染和精索靜脈曲張史等。不育非吸煙組研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn):不吸煙且無被動吸煙史。不育吸煙組研究對象根據(jù)吸煙習(xí)慣和煙齡分為3組:A日吸煙量＜10支,且煙齡≤1年;B日吸煙量10-20支,且煙齡5-10年;C日吸煙量≥20支,且煙齡≥10年。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn),不育吸煙組有63人,其中A組19人,B組22人,C組22人。正常對照組選用35例已生育正常健康體檢男性,無吸煙史,無泌尿、生殖、造血及內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病。

1.2 標(biāo)本采集

禁欲2-7天后通過手淫取精于無菌廣口瓶中,置37℃恒溫箱中液化。液化后取部分精液25℃下,3 000 r/min離心15min,取上清液即精漿-20℃保存待測。

1.3 精液常規(guī)參數(shù)測定

按WHO手冊推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法檢測精液量、粘稠度、液化時(shí)間、pH值等指標(biāo)。采用CASA系統(tǒng)(北京偉力公司W(wǎng)LJY9000)檢測精子總數(shù)、精子密度、精子活率和活力。

1.4 精漿丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量測定

采用南京建成生物技術(shù)工程有限公司生產(chǎn)試劑盒測定,按試劑盒說明書操作,用分光光度計(jì)讀取吸光度值。

1.5 精子凋亡的檢測

試劑:TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒由南京凱基生物技術(shù)有限公司提供;TritonX-100由北京拜爾迪生物公司提供。

方法:標(biāo)本液化后,取10 μ l滴于多聚賴氨酸防脫玻片上,以推血片的方法制作精液涂片;浸入4%多聚甲醛中固定25 min,-20℃的乙醇中放置2 h;PBS漂洗3次,每次5 min;浸入封閉液,室溫15-25℃封閉10 min;PBS漂洗 3次,每次5 min;浸入通透液中,冰上(2-8℃)促滲 2 min。PBS漂洗兩次,樣本周圍用吸水紙吸干;每個(gè)樣本滴加50 μ l TdT酶反應(yīng)液,加蓋玻片37℃避光濕潤反應(yīng)60 min;PBS漂洗3次,樣本周圍用吸水紙吸干;滴加 50 μ l Streptavidin-HRP-工作液,加蓋玻片37℃濕潤避光反應(yīng)30 min;PBS漂洗 3次;滴加50 μ l DAB工作液,室溫顯色反應(yīng)10 min;PBS漂洗3次,光學(xué)顯微鏡下檢測。每張涂片隨機(jī)取10個(gè)油鏡視野(×1 000),計(jì)數(shù)凋亡精子數(shù)和精子總數(shù),以凋亡精子數(shù)/精子總數(shù)×100%表示凋亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,兩組間計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對照組、不育非吸煙組及不育吸煙組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率測定結(jié)果見表1 三組年齡比較無明顯差異。不育非吸煙組及不育吸煙組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率和精漿MDA含量低于正常對照組(P＜0.05),精子凋亡率顯著高于正常對照組(P＜0.05)。不育吸煙組和不育非吸煙組比較精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、精漿MDA含量顯著下降(P＜0.05),而精子凋亡率顯著增高(P＜0.05)。

2.2 A B C三組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率測定結(jié)果見表2 三組年齡比較無明顯差異。B組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、MDA含量低于A組,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異。B組精子凋亡率和A組相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。C組精子密度、精子活率、a+b級精子百分率、MDA含量顯著低于A組和B組(P＜0.05)。C組精子凋亡率顯著高于A組和B組(P＜0.05)。

表1 各組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率的比較

表2 不同吸煙量各組精液常規(guī)參數(shù)、精漿MDA含量和精子凋亡率的比較

3 討論

近年來,吸煙與男性不育的關(guān)系日益受到關(guān)注,但吸煙對精子質(zhì)量的影響各家報(bào)道不一?？赡芘c吸煙者未能準(zhǔn)確提供煙量、起始時(shí)間及某些未知的不育因素等有關(guān)[1]。本研究對健康男性、不育吸煙患者及不育非吸煙患者的研究結(jié)果顯示不育吸煙患者的各精液參數(shù)值明顯下降,且大煙量組精液質(zhì)量下降最為明顯。表明吸煙影響男性精液質(zhì)量,并存在一定的量-效關(guān)系。

目前,吸煙對精液的作用機(jī)制尚不完全清楚。香煙中含有尼古丁、可尼丁、苯并α-芘、一氧化碳、鎘等大量的有害物質(zhì)。對男性的生殖功能的影響是多方面的。吸煙能使男性體內(nèi)激素水平發(fā)生改變,與不吸煙者相比,吸煙男性血清中卵泡刺激素、雌二醇水平顯著上升[2]。吸煙可以增加精液DNA的氧化損害。與不吸煙者相比,吸煙者精液DNA中的8-OhdG(DNA氧化損傷后的一種產(chǎn)物)增加50%,而維生素E的濃度下降32%[3]。長期重度吸煙還可干擾睪丸及附睪微循環(huán)和內(nèi)環(huán)境的物質(zhì)交換,影響睪丸生精細(xì)胞的發(fā)育過程,阻礙精子的發(fā)生和成熟[4]。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和男性生殖的關(guān)系已得到廣泛研究。在男性生殖道中,抗氧化酶系統(tǒng)和非酶性抗氧化物成分使ROS的產(chǎn)生和清除保持動態(tài)平衡。適量低濃度的ROS在精子獲能和頂體反應(yīng)中有著重要的生理作用,但過量活性氧存在可導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,使精子的活力下降、死亡率升高,并影響精子的頂體反應(yīng)及受精功能,是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一[5]。MDA作為活性氧與細(xì)胞多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物,是脂質(zhì)過氧化損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。MDA為極活潑的交聯(lián)劑,可迅速與磷脂酰乙醇胺交聯(lián)成熒光色素后與蛋白質(zhì)、肽類或脂類結(jié)合成難溶的無生理活性的脂褐素沉積于細(xì)胞漿內(nèi),使細(xì)胞功能老化,從而使精子受到損傷,運(yùn)動能力下降。因此通過檢測丙二醛可了解活性氧的濃度。

本研究結(jié)果顯示不育吸煙患者M(jìn)DA含量顯著高于不育非吸煙患者。C組MDA含量顯著高于B組和A組。表明吸煙可以增加精漿活性氧含量,并且吸煙量越大,時(shí)間越長產(chǎn)生的活性氧含量越高。同時(shí)本研究結(jié)果顯示不育吸煙患者精子凋亡率顯著高于不育非吸煙患者,且C組最為明顯。精子凋亡是精子受損的直接表現(xiàn),可以反映吸煙對精子細(xì)胞的損傷情況。長期大量吸煙導(dǎo)致精子凋亡率顯著增加是其增加精漿活性氧含量加重氧化應(yīng)激損傷的嚴(yán)重后果。

由于吸煙可以增加精漿活性氧含量,加重?fù)p害精子細(xì)胞,導(dǎo)致精液質(zhì)量顯著下降,吸煙可以加重不育患者的病情,同時(shí)吸煙也可能是導(dǎo)致不育的唯一因素。對于成年男性尤其是育齡男性,我們應(yīng)加強(qiáng)宣傳力度,提倡不吸煙或戒煙,積極創(chuàng)造條件消除吸煙對人類健康的危害。

[1]武俊青,高爾生.吸煙對男性生殖功能的影響[J].生殖與避孕,2006,26(12):745.

[2]Ochedalski T,Lachowicz O A,Dec W,et al.Examining the effects of tobacco smoking on levels of certain hormones in serum of young men[J].Ginekol Pol,1994,65(2):87.

[3]Fraga CG,Motchnik PA,Wyrobek AJ,et al.Smoking and low antioxidant levels increase oxidative damage to sper m DNA[J].Mutat Res,1996,351(2):199.

[4]Agarwal A,Saleh RA,Bedaiwy MA.Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of human reproduction[J].Fertil Steril,2003,79(4):829.

[5]Agarwal A,Sharma RK,Nalljella KP,et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility[J].Fertil Stefil,2006,86(4):878.