李如凱,郭龍華

(1.深圳市石巖人民醫(yī)院 檢驗科,廣東 深圳518036;2.廣東省中醫(yī)院 檢驗科,廣東 廣州510120)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計資料,全世界范圍內(nèi)不孕不育癥占育齡夫婦的20%左右,其中男性因素導(dǎo)致不孕不育的約占50%[1]。導(dǎo)致男性不育的原因很多,如遺傳因素、營養(yǎng)缺乏、心理因素等,而弱精子癥(Asthenozoospermia)或精子活動力低下被認(rèn)為是導(dǎo)致男性不育的重要原因。有報道,82%的男性不育與精子活動障礙有關(guān),其中20%左右與精子活動力低下直接相關(guān)[2]。弱精子癥的發(fā)生機(jī)制現(xiàn)在還不清楚,其發(fā)生的分子機(jī)制一直是人們研究的重點。在人和哺乳動物的精子中大概含有2000多個轉(zhuǎn)錄本和一系列復(fù)雜的蛋白,這些蛋白在精子運動、獲能和頂體反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[3-6]。目前已經(jīng)證實了一些基因與精子運動有關(guān),其中某些基因在弱精中的表達(dá)顯著降低,是弱精發(fā)生的原因,如:可溶性腺苷酸環(huán)化酶(sAC)[7,8]、鈣離子通道(Catsper)、芳香化酶、睪丸特異蛋白-1(Testis-specific protein1)和乳酸脫氫酶C(Lactate dehydrogenase C)[6]。對于調(diào)控精子運動關(guān)鍵基因的研究有助于揭示弱精精子癥患者的發(fā)生機(jī)制,為臨床弱精子癥患者的治療提供有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 樣本收集與處理

精液標(biāo)本來源于廣東省中醫(yī)院及深圳市石巖人民醫(yī)院的門診病人。嚴(yán)格按照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn),篩選正常人精液(精液量2-6 ml,呈灰白色或淡黃色,pH7.2-7.8,30-60 min全部液化,精子密度≥20×106/ml,精子活力A級≥25%或A+B級≥50%,正常精子形態(tài)≥50%,白細(xì)胞＜1×106)和弱精子癥患者精液(精子活力A級＜25%或A+B級＜30%)。為避免圓形細(xì)胞(生精細(xì)胞和白細(xì)胞)的污染,按文獻(xiàn)方法[5],將液化后的精液經(jīng)Percoll(95%,76%,57%和47.5%)非連續(xù)梯度離心(300×g,25 min),收集95%Percoll以下和57%與76%Percoll層之間的精子。磷酸鹽緩沖液洗滌2次(600×g,5 min),儲存于-80℃?zhèn)溆谩Ｍ瑫r選取含有睪丸生精細(xì)胞和白細(xì)胞的精液標(biāo)本作為C-KIT(生精細(xì)胞標(biāo)志物)和CD45(白細(xì)胞標(biāo)志物)的陽性對照。人對心 、肝 、脾 、肺 、腎 、胃 、腦 、睪丸組織來源于病人活檢、手術(shù)或遺體捐獻(xiàn),患者年齡24-40歲,均有患者及家屬簽定的知情書,并經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 Affymetrix芯片分析

用基因芯片方法來比較正常男性和弱精子癥患者精液精子表達(dá)譜差異,篩選差異表達(dá)基因。人的全基因組芯片(GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0,Affymetrix Comp)涵蓋了47000轉(zhuǎn)錄本,代表了38500多個已經(jīng)明確的基因和EST序列。將純化后精子的cDNA探針與Affymetrix全基因組芯片雜交。芯片購自美國Affymetrix公司,所以實驗操作過程參考該公司實驗手冊。

1.3 生物信息學(xué)分析

NCBI做序列分析和Blastn同源性比較(http:WWW.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。蛋白質(zhì)序列分析采用DNAstar軟件。亞細(xì)胞定位預(yù)測用PSORT II Prediction(http://psort.ims.u-tokyo.ac.ip/form2.htm1)。

1.3 半定量RT-PCR

采用Primer Premer5.0軟件自行設(shè)計引物,并以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參對照。為了避免基因組DNA的污染,上下游引物分別設(shè)計在不同的外顯子上(引物由上海生工合成)。引物序列如下:人 C14orf48,上游引物 5′-CCGTTTCGGTCTGTC TTC ATCC-3′,下游引物 5′-CCGAATAAACGCCCATAGCAG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物大小225 bp;GAPDH:s上游引物 5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′, 下 游 引 物 5′-GAGTCCTTCCACGATACCA-3′,產(chǎn)物為 307 bp 。

取離心后精子,按照RNAfast200 Kit(上海飛捷)提取總RNA。紫外分光光度計定量后于-80℃儲存?zhèn)溆?。采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒(Fermentas公司,美國)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,按照說明書中方法合成cDNA第一鏈,以該鏈cDNA為模板,用上述引物對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在20 μ l的反應(yīng)總體積中加入以下物質(zhì):cDNA(500 ng/20 μ l):2 μ l,引物(10 pmol/L):0.4 μ l,10×PCR buffer:2.0 μ l,MgC12(25 mmol/L):1.6 μ l,dNTP(10 mmol/L):0.4 μ l,TaqDNA 聚合酶(1 μ/μ l):1 μ l。PCR反應(yīng)條件為:94℃4 min,94℃30 s,56℃40 s,72℃35 s,共35個循環(huán),72℃5min,1.5%的瓊脂糖檢測PCR產(chǎn)物大小。

2 結(jié)果

2.1 Affymetrix芯片結(jié)果

Affymetrix芯片探針為1570111-at的雜交信號校正值在正常男性和弱精子癥患者精液精子中分別是141.2(P)和2.8(A)。A:Absent,表示在基因芯片中不表達(dá);P:Present,表示在芯片中表達(dá)?？梢?570111-at探針?biāo)淼幕蛟谌蹙影Y患者精液精子中不表達(dá),在正常男性精液精子中高表達(dá)。以GAPDH為內(nèi)對照,其芯片雜交信號校正值分別是209.2(P)和209.1(P)。

2.2 cDNA序列和蛋白特性的預(yù)測

1570111-at探針代表的基因登錄號為BC031252.1,NCBI做Blastn分析發(fā)現(xiàn),與登錄號為NR-024182的cDNA序列有100%的同源性。NR-024182 cDNA全長1 952 bp,基因名稱為C14orf48,定位14q32.12,含有9個外顯子。用NCBI做Unigene分析發(fā)現(xiàn)該基因的EST序列只在在睪丸組織中檢測到,人其他44個組織或者器官中檢測相對量均為0,說明該基因具有睪丸表達(dá)特異性。生物信息學(xué)預(yù)測該基因編碼140個氨基酸、分子量為15.808 kD的功能未知蛋白質(zhì)Q8NCU1。亞細(xì)胞定位預(yù)測該基因在細(xì)胞質(zhì)(39.1%)和細(xì)胞核(34.8%)中表達(dá)。

2.2 C14orf48在精液精子中的RT-PCR結(jié)果

正常男性和弱精子癥患者組各選20例精液精子進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),均沒有檢測出C-KIT(生精細(xì)胞標(biāo)志物)和CD45(白細(xì)胞標(biāo)志物),表示純化結(jié)果良好,沒有白細(xì)胞和不成熟精子的污染。RT-PCR結(jié)果顯示,弱精子癥患者精液精子中沒有檢測到C14orf48表達(dá),而該基因在正常男性精液精子中則表達(dá)強烈。內(nèi)參GAPDH在正常和弱精子患者中表達(dá)沒有差異。如圖1所示。

圖1 C14orf48在正常男性(N)和弱精子癥患者精液精子中的表達(dá)(A)

2.4 C14orf48多組織RT-PCR結(jié)果分析

在人 8種組織(心 、肝 、脾、肺 、腎 、胃、腦 、睪丸)RT-PCR結(jié)果表明,C14orf48基因在睪丸中呈現(xiàn)特異性表達(dá),能夠看到225 bp的PCR產(chǎn)物。而其他組織中均不表達(dá)(圖3)。陽性內(nèi)對照GAPDH均有特異性RT-PCR產(chǎn)物。

圖2 C14orf48人多種組織的RT-PCR結(jié)果

3 討論

弱精子癥(精子活動力低下)是男性不育癥最常見的精液異常改變之一,因其病因復(fù)雜,目前尚未有明確有效的治療方法,多以內(nèi)分泌治療和輔助生育技術(shù)為主要方法而達(dá)到男性生育的目的。目前認(rèn)為,與精子運動相關(guān)的幾個生理過程是保證男性正常生育的重要基礎(chǔ),(1)精子尾部的大體形態(tài)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);(2)精子的能量代謝,包括糖酵解和氧化磷酸化,此過程產(chǎn)生ATP;(3)調(diào)控精子運動的信號傳導(dǎo)通路,包括cAMP/PKA信號傳導(dǎo)通路,鈣信號傳導(dǎo)通路,小G蛋白信號傳導(dǎo)通路[9,10]。根據(jù)以上分析可以推測弱精子癥的發(fā)生可能是以上某個環(huán)節(jié)發(fā)生問題所導(dǎo)致的結(jié)果。

本實驗通過比較弱精子癥患者和正常男性精液精子的基因表達(dá)譜,找到了差異基因C14orf48,該基因在弱精子患者中的表達(dá)明顯缺失,并通過PT-PCR的方法進(jìn)一步得到驗證。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因僅在睪丸中特異性表達(dá),在人類其他44種組織中不表達(dá),RT-PCR結(jié)果表明在人8種組織中僅在睪丸組織中表達(dá)。因此推測C14orf48基因的表達(dá)產(chǎn)物可能通過以上三種機(jī)制參與的精子運動,該基因在弱精子癥患者精液精子中的表達(dá)缺失可能是弱精子癥發(fā)生的原因之一。目前該基因的功能未知,進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能,對于揭示人類弱精子癥的發(fā)生機(jī)制具有重要意義。

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