張滿英,景 影*,李 蕊,畢經(jīng)瑞,孫連坤,婁長芹

(1.吉化集團(tuán)公司總醫(yī)院,吉林吉林市132022;2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室)

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性突觸傳遞的主要神經(jīng)遞質(zhì),維持正常腦功能,但較高濃度谷氨酸則具有神經(jīng)毒性作用[1],中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)含有大量興奮性氨基酸[2],幾乎所有的神經(jīng)元都含有谷氨酸受體,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,到目前已克隆出8種mGluRs,分別命名為 mGluR1-mGluR8,mGluR1-3,mGluR5-7的腦保護(hù)作用已被證實(shí)[3],由于mGluR-4、mGluR-6受體分布的局限性及缺少對不同亞型受體選擇性作用的藥物,它們與腦損傷及神經(jīng)保護(hù)劑的作用還需進(jìn)一步證實(shí)。

糖尿病是缺血性腦血管病的危險因素,高血糖對缺血性腦卒中的病情和轉(zhuǎn)歸有負(fù)面影響[4]。目前關(guān)于糖尿病腦損傷時代謝型谷氨酸受體及谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)方面報道較少,本研究著重觀察糖尿病腦損傷大鼠代謝型谷氨酸受體、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體基因的表達(dá)情況,探討他們在腦保護(hù)方面的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 清潔級近交系Wistar大鼠28只,雌雄不限,重約160-200 g,購自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。STZ、戊巴比妥鈉購自Sigma公司。鼠隨機(jī)分成A(常規(guī)飼料喂養(yǎng)組,n=14)、B(高糖高脂飼料喂養(yǎng)+STZ注射誘導(dǎo)胰島素抵抗,即模型組,n=14)二組,自由進(jìn)食水,12 h光照周期。

1.2 試劑與儀器 PCR擴(kuò)增儀、PCR熱循環(huán)儀、DL2000DNA Marker、Taq DNA聚合酶均產(chǎn)自TAKARA公司,日本;RNA定量儀,SANYO,日本;PCR引物合成由聯(lián)星公司,中國;兔抗大鼠胰島素多克隆抗體,麥新公司,美國。

1.3 糖尿病大鼠模型的建立

高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠飼養(yǎng)一個月后,B組大鼠一次性腹腔注射60 mg/kgSTZ(以pH4.2的11 mol/L枸櫞酸緩沖液配成125%濃度)誘導(dǎo)糖尿病,A組僅注射枸櫞酸緩沖液作對照。測定血糖。血糖測定采用葡萄糖氧化酶法。血標(biāo)本在1%戊巴比妥麻醉下(30 mg/kg)從眼內(nèi)眥靜脈取,EDTA抗凝。胰腺組織胰島素染色:常規(guī)方法處理玻片,脫蠟,3%H2O2孵育 25 min,阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,PBS洗 5 minx3,正常羊血清50 μ l/片滴于組織片上封閉非特異蛋白,室溫下孵育20 min,封閉非特異位點(diǎn),FITC(中山公司)發(fā)色,視顯色強(qiáng)度而定時間。

1.4 PCR 檢測 EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA表達(dá)

取凍存的6個月糖尿病鼠腦組織100 mg,加入1 ml Trizol,用勻漿機(jī)把組織攪碎,室溫放置5 min,使其充分裂解。離心、沉淀、干燥后提取細(xì)胞總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用相關(guān)基因的引物擴(kuò)增其基因的片段,觀察mRNA表達(dá)情況。反應(yīng)條件:循環(huán)1 95℃5 min,循環(huán) 2 94℃30 s,56℃1 min,72℃1 min,30循環(huán) ,循環(huán) 3 72℃ 10 min。EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6引物序列分別為:正義5'-CCCGGAAGAACCCCTGGGTTT-3',反義 5'-GTTCATT GTCCTG GGCAATCA-3',PCR產(chǎn)物572 bp;正義 5'-TGAGCTACGTGCTGCTGGCG-3',反義 5'-TGTCGGCTGACTGTGAGGTG-3',PCR產(chǎn)物 329 bp;正義 5'-CAAGTAGCAAGGTTGAGTGT-3'反義5'-GGTTGTAGTGTTGGATCAAG-3'PCR產(chǎn)物280 bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

各組數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS11.5軟件分析,各實(shí)驗(yàn)組間均值比較采用ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 大鼠空腹血糖濃度

模型組空腹血糖20.016±1.984 mmol/L,對照組空腹血糖3.882±0.123 mmol/L(P＜0.01),模型組空腹血糖明顯高于正常(＜7.0 mmol/L),符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 大鼠胰腺組織胰島素染色

激光共聚焦顯微鏡下觀察組織中胰島素表達(dá),照相。結(jié)果顯示對照組胰腺組織中可見大量胰島細(xì)胞,糖尿病模型組胰腺組織中胰島細(xì)胞顯著減少。

2.3 PCR檢測大鼠腦皮質(zhì) EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表達(dá)

反應(yīng)結(jié)束后,進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并照相記錄。RT-PCR結(jié)果顯示:糖尿病模型組mGluR-6 mRNA表達(dá)與對照組相比明顯增強(qiáng)(P＜0.05),而 EAAT-1、mGluR-4 mRNA表達(dá)與對照組相比略有增強(qiáng),但未見統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 胰腺組織胰島素染色

圖2 RT-PCR檢測大鼠腦皮質(zhì) EAAT-1、mGluR-4、mGluR-6 mRNA的表達(dá)

3 討論

糖尿病合并腦損傷已成為當(dāng)前嚴(yán)重危害人類生命與健康的常見因素[5],其發(fā)病后癥狀重、預(yù)后差、死亡率高,給社會和家庭帶來的沉重影響越來越得到學(xué)者的關(guān)注,腦損傷的發(fā)病機(jī)制仍不很明確,研究認(rèn)為可能主要與糖尿病代謝紊亂所致的微血管、大血管病變以及血液流變學(xué)和抗凝纖溶系統(tǒng)異常有關(guān)[6]。

為探討糖尿病合并腦損傷的發(fā)病機(jī)制,我們對復(fù)制的糖尿病大鼠模型從分子生物學(xué)角度在腦神經(jīng)代謝方面進(jìn)行相關(guān)檢測和對照研究,旨在為闡明糖尿病腦損傷的機(jī)制及為臨床預(yù)防和治療糖尿病并發(fā)腦損傷提供科學(xué)的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)是對通過飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗的大鼠一次性STZ注射,誘發(fā)產(chǎn)生糖尿病模型,客觀真實(shí)的模擬腦損傷的過程,符合臨床發(fā)病規(guī)律。經(jīng)胰島素染色和血糖測定結(jié)果證實(shí)糖尿病動物模型是成功的。

本研究提示:6個月糖尿病大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)代謝型受體mGluR-6表達(dá)增加,說明mGluR-6可能在糖尿病腦損傷的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著一個重要的角色,本研究認(rèn)為糖尿病鼠腦谷氨酸釋放增多,導(dǎo)致與腦缺血、缺氧及變性疾病有關(guān)的興奮毒作用[7],mGluR-6可減少或阻斷突觸前谷氨酸的釋放,減少缺血引起的腦組織損傷,起到腦保護(hù)作用,為進(jìn)一步探索腦損傷機(jī)制及神經(jīng)保護(hù)提供了理論依據(jù)。

[1]虞希沖.谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體與神經(jīng)細(xì)胞毒作用[J].中國臨床藥理學(xué)與治理療學(xué),2003,8(5):490.

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[4]王 瑩,張朝東.糖尿病與缺血性腦血管病的相關(guān)性[J].中國臨床康復(fù),2003,7(31):4276.

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