孫樹東,徐 峰,齊 欣,劉建國

(1.吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院骨科,吉林長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科)

聚乳酸因?yàn)闊o毒性、細(xì)胞相容性和可降解性[1]成為最早作為骨、軟骨組織工程的支架材料,也是目前運(yùn)用最為廣泛的骨組織工程材料[2],但由于其生物活性較差,限制了其在醫(yī)學(xué)生物材料方面的應(yīng)用。本文嘗試通過靜電紡絲這種方法對(duì)聚乳酸材料進(jìn)行改性,探討改性后材料的表面特征,并進(jìn)一步探討通過靜電紡絲導(dǎo)致材料表面、空間結(jié)構(gòu)的變化對(duì)材料的親水性和降解速度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要的試劑和儀器

直流電高壓發(fā)生器(北京);電紡絲接受器;超聲粉碎儀(BS14-UH武漢);高分子材料接觸角測(cè)定儀(德國Dataphysics);掃描電鏡(JSM-6700F)(以上儀器由吉林大學(xué)高分子實(shí)驗(yàn)室);收集紡絲載體為1 cm×1 cm大小的載玻片(自己制作);表面活性劑(C20 H37O7SNa);二氯甲烷;聚乳酸(PLA)(吉林大學(xué)高分子實(shí)驗(yàn)室提供)

1.2 三種濃度聚乳酸(PLA)電紡構(gòu)建具有超微結(jié)構(gòu)生物材料

分別將濃度為6%、8%和10%PLA,在最佳的電紡條件[3]下進(jìn)行電紡,將不同大小的硅片至于鋁箔之上,將聚乳酸電紡絲收集并通過掃描電鏡觀察形態(tài)。戊二醛交聯(lián)后備用。

1.3 三種濃度PLA電紡材料的表面形態(tài)觀察和分析

通過光鏡觀察,粗略觀察電紡絲直徑,形成的電紡絲膜情況。選擇液滴較少的樣本進(jìn)行掃描電鏡觀察后,通過圖像軟件測(cè)量各種樣本的直徑。通過下述公式計(jì)算支架的密度和孔隙率。支架密度計(jì)算公式(g/cm3)=電紡材料質(zhì)量(mg)÷(支架的厚度μ m×面積cm2);支架的孔隙率(%)=(1-支架密度(g/cm3))÷聚乳酸密度(g/cm3));聚乳酸的密度(Mr=300 000)=289.5 mg/cm3(計(jì)算)。

1.4 三種濃度PLA生物材料接觸角測(cè)量

將待測(cè)支架樣本放在試樣臺(tái)上。3 μ l的蒸餾水噴射在支架樣本上,使液體成液滴狀懸垂在支架樣本上。調(diào)準(zhǔn)顯微鏡焦距,拍攝下液滴懸垂在支架表面的照片,通過計(jì)算機(jī)內(nèi)程序計(jì)算出材料表面的接觸角。每個(gè)樣本取3組數(shù)據(jù)。

1.5 三種濃度PLA生物材料的降解率測(cè)定

①將無電紡絲支架的玻璃片載體(1 cm×1 cm)稱重(W);②將8%的聚乳酸在其最佳電紡條件下電紡2 h,用上述的玻璃片載體收集,戊二醛交聯(lián),制備18個(gè)樣本;③將普通的8%聚乳酸溶液在玻璃片載體上涂片后戊二醛交聯(lián),制備18個(gè)樣本;④將上述樣本低壓干燥后稱重(W0);⑤將上述的2組樣本經(jīng)過紫外線中照射30min后,將樣本孵育在37攝氏度PBS(溶液中1M,PH7.2)一周一換;⑥分別在 1、2、3周更換PBS溶液時(shí),每組取出6個(gè)樣本經(jīng)過蒸餾水沖洗后三次 ,低壓干燥稱重(Wt、t=1、2、3w);⑦用重量丟失率表示材料的降解率D=[(W0-W)-(Wt-W)]/(W0-W)。

1.6 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 三種濃度PLA電紡材料在掃描電鏡和光鏡下觀察電紡結(jié)果

10%、8%、6%三種濃度的聚乳酸溶液都在相應(yīng)的電紡條件下紡出電紡絲,電紡絲的直徑和濃度成反比。10%濃度的PLA電紡絲直徑最大,6%濃度的PLA電紡絲直徑最小。8%濃度的PLA電紡絲直徑較均勻,且表現(xiàn)出其特有的表面特征。

2.2 不同濃度的PLA靜電紡絲的支架的參數(shù)

將采集的掃描電鏡圖片經(jīng)過圖像分析軟件測(cè)定其平均直徑、薄膜的厚度、用公式計(jì)算出相應(yīng)的支架密度和孔隙率,得出在相同的電紡條件下,聚乳酸濃度對(duì)電紡支架纖維直徑、支架密度和孔隙率的影響,見表1。

通過組與組間T檢驗(yàn)結(jié)果為:電紡材料的濃度對(duì)纖維直徑和支架密度影響有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:10%PLA＞8%PLA＞6%PLA(P＜0.01);對(duì)支架材料的孔隙率影響有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異:10%PLA＜8%PLA＜6%PLA(P＜0.01)。

2.3 兩種聚乳酸材料接觸角測(cè)量結(jié)果

電紡聚乳酸接觸角小于相對(duì)應(yīng)的普通材料組(t檢驗(yàn),P＜0.01)。見表2。

表1 不同濃度的PLA電紡支架的參數(shù)(±s,n=6)

表1 不同濃度的PLA電紡支架的參數(shù)(±s,n=6)

?

表2 兩種材料的接觸角測(cè)量(±s,n=8)

表2 兩種材料的接觸角測(cè)量(±s,n=8)

1 2 3 4 5 6 7 8 ±s普通聚乳酸 82.2 79.8 79.5 88.9 87.0 85.1 89.1 83.3 84.36±1.34電紡聚乳酸 78.7 64.2 76.4 67.5 78.1 66.9 76.5 69.1 72.18±2.06

2.4 兩種材料降解率的測(cè)定

電紡聚乳酸的降解速度在1 W、2 W、3 W要低于普通聚乳酸的降解速度(P＜0.01),尤其以第三周的降解速度進(jìn)一步降低。見表3。

表3 不同支架在1W、2W、3W的重量(mg)丟失的測(cè)定(±s,n=6)

表3 不同支架在1W、2W、3W的重量(mg)丟失的測(cè)定(±s,n=6)

樣本降解率% 1 W 2 W 3 W PLA 0.60±0.01 1.47±0.01 2.22±0.03 PLA 電紡 0.54±0.01 1.40±0.01 1.96±0.02

3 討論

最近的研究表明天然的骨基質(zhì)是一種復(fù)雜納米、微米結(jié)構(gòu)的、三維立體多孔的細(xì)胞支持體[2],骨微結(jié)構(gòu)的明確指明了骨組織工程材料設(shè)計(jì)發(fā)展的方向。骨組織工程構(gòu)建理想生物材料的有效方法之一是仿生天然骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)[4],為細(xì)胞粘附、增殖和分化提供最佳的環(huán)境。在天然的骨基質(zhì)中結(jié)構(gòu)特征方面是納米、微米級(jí)結(jié)構(gòu),并且細(xì)胞的分化和功能高度的依賴這種微結(jié)構(gòu)[5]。聚合物及其混合物的納米、微米結(jié)構(gòu)多孔材料被認(rèn)為是生物工程中最前沿的生物材料應(yīng)用在骨組織工程[6]。近10年來,靜電紡絲被認(rèn)為是一種將聚合物和無機(jī)物制作成具有高面積體積比和高孔隙率的纖維材料的簡(jiǎn)單、有效的方法[4],并適合多種聚合物[7]。更進(jìn)一步的說,通過靜電紡絲構(gòu)建的絲狀基質(zhì)材料具有仿生天然骨基質(zhì)納米、微米、多孔隙的形態(tài)學(xué)特征等特點(diǎn)。

聚乳酸(PLA)是目前運(yùn)用最為廣泛的骨組織工程材料[2],已經(jīng)成為電紡的熱門材料。本研究成功的應(yīng)用靜電紡絲這種簡(jiǎn)單、有效的方法,將生物活性較差的普通聚乳酸材料構(gòu)建成仿生天然骨基質(zhì)膠原纖維空間結(jié)構(gòu)的新型生物材料,該組材料在空間結(jié)構(gòu)上由微米級(jí)的聚乳酸纖維不規(guī)則排列構(gòu)成,材料內(nèi)部空間具有相會(huì)貫通的微米級(jí)空隙,可以為細(xì)胞、營養(yǎng)液的遷移提供通道。聚乳酸的濃度對(duì)聚乳酸纖維的直徑、支架的密度和材料的孔隙率均有影響:聚乳酸電紡絲的直徑和支架密度與溶液的濃度成正比關(guān)系;PLA靜電紡絲支架的孔隙率和電紡液的濃度成反比。其中8%聚乳酸電紡支架的纖維直徑、空隙較其他兩種濃度的材料均勻,0.88±0.12微米的纖維直徑和72%的孔隙率也較接近天然松質(zhì)骨的纖維直徑和孔隙率80%[8],可以說我們的試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了一部分天然骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)仿生的關(guān)鍵。

另外,接觸角的測(cè)定是評(píng)估生物材料表面能和親水性的常用方法[9],而材料的表面能和親水性是影響和控制蛋白質(zhì)和細(xì)胞與材料相互作用的重要因素,二者能夠影響蛋白的吸收和材料表面蛋白的結(jié)構(gòu)重排[10],因此一直以來是生物材料科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)備受關(guān)注的課題。接觸角測(cè)量的結(jié)果看兩種材料的接觸角均＜90°,從材料的親水和疏水的區(qū)分來看,所有的材料均屬于親水材料。通過我們對(duì)兩種材料接觸角的測(cè)量,電紡后聚乳酸材料的接觸角明顯小于普通聚乳酸,說明經(jīng)過靜電紡絲可以明顯改善材料的親水性,為材料表面的改性提出新的思路。

骨組織工程對(duì)材料的要求要有一定的強(qiáng)度和體內(nèi)存留的時(shí)間,來保證新生骨達(dá)到強(qiáng)度以前對(duì)骨的負(fù)重,因此材料的降解速度是影響材料生物材料應(yīng)用的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究表明電紡后的聚乳酸可以明顯降低材料的降解速度,為提高其他因降解速度過快而影響支架強(qiáng)度的材料改性提供新的契機(jī)。

[1]Dedai L.Synthesis,characterization and properties ofbiodegradable polylacticacid-b-cyclodextrin cross-linked copolymermicrogels[J].EuropeanPolymer Journal,2008,44:2140.

[2]Shieh S,Vacanti J.State of the art tissue engineer:From tissue engineer to organ building[J].Surgery,2005,137(1):1.

[3]徐 峰,齊 欣,劉建國.聚乳酸電紡構(gòu)建仿生骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)生物降解材料的體外細(xì)胞毒理研究[J].中國老年學(xué)雜志,2009,29(1):68.

[4]Joerg K,AchimM.Matrices and scaffolds for protein delivery in tissue engineering[J].Advanced Drug Delivery Reviews,2007,59(4-5):274.

[5]Liu X,Laura A.Biomimetic nanofibrous gelatin/apatite composite scaffolds for bone tissue engineering[J].Biomaterials,2009,30(12):2252.

[6]Oliva A,Salerno A,Locardi B,et al.Behaviour of human osteoblasts cultured on bioactive glass coatings[J].Biomaterials,1998,19(11-12):1019.

[7]Silveira.Harvest and characterization of mesenchymal canine stem cells fromadipose tissue and bone marrow[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,2009(128):211.

[8]Zhong S,Teo W E,Zhu X,et al.An aligned nanofibrous collagen scaffoldby electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture[J].Journal of Biomedical Materials Research Part A,2006,79A(3):456.

[9]Lam C,Wu R,et al.Study of the advancing and receding contactangles:liquid sorption as a cause of contactangle hysteresis[J].Advances in Colloid and Interface Science,2002,96(1-3):169.

[10]Anselme K.Osteoblast adhesion on biomaterials[J].Biomaterials,2000,21(7):667.