張舵舵,趙燕穎,張 妍,劉 玲,高振平*

(1.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;3.吉林大學(xué)第四臨床醫(yī)院;4.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)部)

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤,大多數(shù)膠質(zhì)瘤惡性程度高,侵襲性強,手術(shù)不易完全切除,術(shù)后復(fù)發(fā)率高,病人預(yù)后不良。p53蛋白具調(diào)節(jié)細胞生長和誘導(dǎo)凋亡的作用,MDM2作為一個癌基因主要是抑制野生型p53的激活轉(zhuǎn)錄功能和抗腫瘤活性。研究發(fā)現(xiàn)MDM2蛋白的過度表達導(dǎo)致同時表達的p53蛋白量減少導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[1]。研究報道MDM2癌基因在肉瘤、膀胱癌、膠質(zhì)瘤、肺癌等都有過度表達[2]。本研究體外合成特異性針對MDM2基因的siRNA,研究siRNA對MDM2基因的阻抑作用和對人膠質(zhì)瘤細胞的生長增殖抑制作用,為膠質(zhì)瘤的基因治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

SilencerTM siRNA construction kit(Ambion公司);LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen);胎牛血清、IMDM 培養(yǎng)基(Gibco公司);MTT、RT-PCR kit(Promega)、引物由上海生工生物技術(shù)公司合成;U251細胞株(中國科學(xué)院上海細胞所)。

1.2 siRNA的設(shè)計和合成

根據(jù)已知Genebank中MDM2mRNA序列和siRNA的設(shè)計原則[4],利用Ambion公司的在線設(shè)計來尋找靶序列,并做同源序列搜索,排除那些和其他編碼序列或EST同源的序列,用silencerTM siRNA construction kit體外合成si-MDM2-1,si-MDM2-2,陰性對照control siRNA購于Ambion,與任何編碼序列無同源性。

1.3 細胞培養(yǎng) 人膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞IMDM培養(yǎng)液(10%胎牛血清,青霉素100 μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml)中,37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。常規(guī)更換培養(yǎng)液、消化傳代,實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染 對數(shù)生長期細胞在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞融合率達80%-95%時開始轉(zhuǎn)染。操作按LipofectamineTM 2000試劑說明書進行。分四組轉(zhuǎn)染:空白對照組(只加轉(zhuǎn)染試劑),轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染兩個siMDM2質(zhì)粒組,瞬時轉(zhuǎn)染后提取細胞RNA以備后續(xù)實驗用。

1.5 半定量RT-PCR 收集轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞,分別提取總RNA,紫外分光光度計定量。RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA,然后進行PCR擴增。MDM2擴增產(chǎn)物為450 bp,上游引物為:5′-AATCATCGGACTCAGGTA-3′,下游 引物為:5′-CTTCACTAAGGCTATAATCTTC-3′;β-actin擴增產(chǎn)物為 520 bp,上游引物為 :5′-GGGACCTGACAGACTACCT-3′下游引 物為:5′-CGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。擴增 條件:94℃變性45秒,56℃退火45秒,72℃延伸1分鐘,30個循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠系統(tǒng)電泳(含溴化乙啶),拍照鑒定。用Pharmacia ImageMaster凝膠成像儀觀察,并用ImageMaster軟件分析條帶峰面積。

1.6 MTT檢測細胞增殖抑制率 以5×103/孔將對數(shù)生長期細胞接種于96孔板,培養(yǎng)至細胞貼壁后轉(zhuǎn)染(分組同上),轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組使其終濃度達50 nmol/L,轉(zhuǎn)染 24、48 、72 h 后,每孔加入 15 μ L MTT(5 mg/ml)培養(yǎng) 4 h,再加入150 μ L/孔的 DMSO,振蕩 10分鐘,用酶標儀570 nm處測定吸光度(A)值。根據(jù)公式:細胞增殖抑制率(%)=(1-處理組吸光度/未處理組吸光度)×100%,計算出抑制率。每組均設(shè)4個平行孔,重復(fù)3次。

1.7 流式細胞術(shù)檢測凋亡 取對數(shù)生長期細胞按7.5×105/瓶接種到培養(yǎng)瓶,分組同上。培養(yǎng)72 h后消化收集細胞,用冰冷PBS洗2次,制備成單細胞懸液,用冰冷70%乙醇固定過夜,碘化丙啶染色,流式細胞儀檢測凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒酶切和測序鑒定 構(gòu)建的Si MDM2真核表達質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定,電泳結(jié)果為大片段的載體片段和63 bp的目的片段,與預(yù)計片段長度相同(圖1)。將重組質(zhì)粒PGCsilencerTM-MDM2-siRNA送上海生工測序,序列完全與目的序列相同,表明siRNA MDM2構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.2 半定量RT-PCR 以β-actin作為內(nèi)參照,對靶基因mRNA進行定性定量分析,MDM2和β-actin引物的擴增基因片段經(jīng)電泳后,結(jié)果顯示擴增片段大小分別為450bp和520bp。轉(zhuǎn)染siMDM2-1,2組MDM2 mRNA表達明顯減少,而轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒組MDM2 mRNA表達水平無明顯改變。半定量掃描分析,轉(zhuǎn)染si-MDM2-1 si-MDM2-2中MDM2-mRNA的表達量分別下降至對照組的31.61%,40.18%(P＜0.05);陰性對照質(zhì)粒組的MDM2-mRNA表達為對照組的97.9%,與空白對照組無明顯差異(P＞0.05)。(圖2)

圖2 比較轉(zhuǎn)染PGCsilencerTM-MDM2-siRNA質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒后中MDM2-mRNA的表達的變化

2.3 siMDM2轉(zhuǎn)染后對細胞增殖的影響 MTT法結(jié)果表明轉(zhuǎn)染siMDM2后細胞的增殖速度和分裂指數(shù)都明顯降低;增殖抑制率隨時間的增加而增高:siMDM2-1和siMDM2-1組的增殖抑制率和空白對照組比差異具有顯著性,(P＜0.05);而且,24、48、72 h各時間組間的抑制率差異也有顯著性(P＜0.05)。

2.4 siMDM2轉(zhuǎn)染后對U251細胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染siMDM2-1,2后72 h,檢測細胞凋亡率分別為49.9%,40.0%,轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒組未見明顯凋亡。SiMDM2-1組和si MDM2-2組細胞處于S期的百分率分別為30.8%和 33.1%,明顯低于對照組(56.1%);而SiMDM2-1組和SiMDM2-2組細胞處于G0/G1期的百分率高于對照組。

圖3 siMDM2對細胞增殖的影響

3 討論

腦膠質(zhì)細胞瘤是臨床上顱內(nèi)腫瘤中最常見的一種。近年人們認識到膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是多個癌基因和抑癌基因異常改變的結(jié)果,與癌基因的激活、過表達或擴增,抑癌基因的缺失或突變失活密切相關(guān)。尤其是MDM2基因的擴增或過表達及p53基因突變在其中起著舉足輕重的作用。

抑癌基因p53誘導(dǎo)細胞凋亡和DNA修復(fù),而MDM2能抑制p53的功能,并啟動p53泛素化和核輸出而誘導(dǎo)p53的降解[5]。研究表明,P53抑癌基因的失活及原癌基因MDM2的激活促使細胞異常增殖,從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6]。p53基因突變失活是膠質(zhì)瘤常見的遺傳學(xué)改變之一,MDM2在膠質(zhì)瘤中的擴增與表達和腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān),在膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Ichimura和Park[7,8]等曾報道在膠質(zhì)母細胞瘤及間變性星形細胞瘤有MDM2基因過度表達。并在高度惡性的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)有高水平的MDM2癌基因產(chǎn)物的表達;故認為MDM2與膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

SiRNA可以特異性地降解相應(yīng)基因的mRNA,從而抑制該基因的表達。微量的siRNA即可使其編碼致病基因產(chǎn)物的含量明顯下降,達到剔除的效果;同時,siRNA的抑制作用具有嚴格的序列特異性,治療的針對性強,副作用小。因此,siRNA技術(shù)為腫瘤基因治療提供了一個新的可供選擇的策略和技術(shù)平臺。

本實驗我們設(shè)計合成了2對針對MDM2基因的干擾位點序列的siMDM2[3]。將構(gòu)建的siMDM2真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞后進行基因水平和凋亡的檢測。MDM2的2個干擾位點都具有強效的干擾效果。RT-PCR結(jié)果顯示siMDM2能有效地阻抑MDM2基因的表達,阻抑效應(yīng)平均達到64.11%。MTT和流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:瞬時轉(zhuǎn)染siMDM2-1和siMDM2-2能有效抑制細胞增殖,使U251細胞增殖速度減慢,增殖抑制率與對照組比有顯著差異,并且隨著時間增殖抑制率有所增加。同時,發(fā)現(xiàn)si MDM2能誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡,而且使S期細胞減少,G0/G1期的細胞百分比增多,其細胞阻滯作用可能是其可以誘導(dǎo)細胞凋亡的原因之一。

本實驗繼呂佳音[9]等人對關(guān)于siMDM2對骨肉瘤的增殖影響的研究后進一步證明了siMDM2對膠質(zhì)瘤細胞也同樣存在增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。提示在膠質(zhì)瘤治療中,以MDM2基因為靶點,利用siRNA技術(shù)進行基因治療有可能成為一種新的有效手段,本研究亦為后續(xù)的對其他腫瘤長效抑制的研究工作打下了堅實的基礎(chǔ)。

[1]Phan J,Li Z,Kasprzak A,et al.Structure-based design of high-affinity peptides inhibiting the interaction of p53 with MDM2 and MDMX[J].J Biol Chem,2009,12(12):1.

[2]Pacinda SJ,L edet SC,Geondo MM,et al.p53 andMDM 2 immuno staining in pulmonary blastomas and bronchogenic carcinomas[J].Human Pathol,1996,27:542.

[3]Khatri RG,Navaratne K,Weil RJ.et al.The role of a single nucleotide polymorphism of MDM2 in glioblastoma multiforme[J].J Neurosurg,2008,109(5):842.

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[9]呂佳音,吳丹凱,趙燕穎,等.siRNA對骨肉瘤U2OS細胞株MDM2-mRNA表達的抑制作用[J].中國實驗診斷學(xué),2007,11(7):878.