高 琴，徐麗敏

（天津市長征醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，目前治療方法雖多，但總體效果欠佳。我科自擬“七皮飲”治療銀屑病，自1999年應用至今，臨床觀察療效顯著。本研究觀察“七皮飲”對角質形成細胞增殖及細胞周期的影響，以探討其作用機制，為其治療銀屑病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：永生化人類角質細胞株HaCaT，由中國醫(yī)科大學提供。主要試劑：MTT（SIGMA 公司）；碘化丙啶（PI）染料（Sigma公司）；RNA酶A（Sigma公司）。主要儀器：流式細胞儀（FACSCalibur型美國BD公司）

1.2 實驗方法

1.2.1 中藥的制備 研磨單味及復方中藥為粉末狀，三蒸水冷浸泡2周后，汲出藥液，過濾，-80℃冷凍，用Ct60冷凍干燥箱冷提為粉劑，-20℃保存。待用時再用DMEM培養(yǎng)液調整濃度，過0.22μm濾膜除菌。

1.2.2 MTT法測定細胞增殖率（relative growth rate,RGR） 細胞種板，貼壁后加入不同濃度的藥物，終濃度分別為 5、10、15、20、25mg/mL，培養(yǎng) 48～72 h，進行MTT檢測，每個濃度設5個復孔，實驗重復3次。具體方法如下：分別在每孔加入5mg/mL的MTT100μL，孵育4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150 μL，室溫震蕩10min，以490nm波長檢測各孔的光吸收值。細胞增殖率=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.2.3 細胞接種 取對數(shù)生長期HaCaT細胞，用0.25%胰酶/EDTA消化制成單細胞懸液，調整細胞數(shù)成3×105個/mL接種于12孔培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液1mL，以不加中藥組為對照。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間隨時在倒置相差顯微鏡下觀察細胞貼壁及生長情況。待細胞生長接近融合狀態(tài)時，藥物組每孔加入中藥500μL（終濃度分別為25、12.5、6.25mg/mL），對照組培養(yǎng)孔加入500μLDMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。對照組及各濃度組各接種3個培養(yǎng)孔，培養(yǎng)時間分別為 24h、48h、72h。

1.2.4 PI染色法 分別于24、48、72 h后取出細胞培養(yǎng)板，加入0.25%胰酶/EDTA消化收集細胞懸液，800r/min離心8min，PBS洗滌2次，加入冰預冷的70%乙醇2mL破膜固定，4℃保存1～2h；800r/min離心8min，棄去固定液，PBS重懸5min；400目篩網(wǎng)過濾1次，800r/min離心8min，棄去PBS；加入1mL已配好的碘化丙啶 (PI)染液，4℃避光保存30min，30min內上機分析。

1.2.5 流式細胞儀測定 PI用氬離子激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630 nm，產(chǎn)生紅色熒光，可分析前散射光和對側散射光的散點圖及PI熒光的直方圖。

應用流式細胞儀進行測量，經(jīng)488nm激光激發(fā)，得出DNA示意圖，圖中第一個峰（G1）是DNA含量為2N的細胞峰，第二個峰（G2）是DNA含量為4N的細胞峰，兩峰之間是DNA含量為2N～4N的處于活躍的DNA合成期（S期）的細胞。依CellQuest軟件,每個樣本獲取10 000個細胞，用廠家提供的Multicycle軟件，對上述所測細胞的熒光強度進行分析，計算機可自動計算出G1%、S%、G2%。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SAS8.1統(tǒng)計分析軟件完成實驗數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用x±s表示，采用析因設計的兩因素多水平方差分析。

2 結果

2.1“七皮飲”及七味單藥對HaCaT細胞增殖密度和形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下可見，HaCaT細胞藥物組和對照組細胞增殖密度相比較，用“七皮飲”處理48h后6.25mg/mL組細胞密度有所減少，有部分細胞懸??；12.5mg/mL組細胞生長停滯，密度減小，懸浮細胞增多；25mg/mL組可見大部分細胞已懸浮。

MTT法測定八種藥物不同濃度下的RGR，結果表明地骨皮對HaCaT細胞具有增殖作用，其它七種藥物則對HaCaT細胞具有抑制作用，其中“七皮飲”對細胞的抑制作用最強，且均存在劑量依賴關系，見表1。

表1 八種藥物不同濃度RGR（±s） %

表1 八種藥物不同濃度RGR（±s） %

注：對照組為100%。

5mg/mL 116.13±29.80 96.41±12.09 123.11±20.90 88.79±21.42 92.57±11.13 89.42±11.74 94.79±8.03 88.17±14.23 10mg/mL 116.99±31.48 72.07±15.85 108.62±15.53 55.16±27.49 75.569±10.79 69.61±15.98 92.26±8.87 53.67±23.10 15mg/mL 127.31±32.13 60.30±13.91 88.13±11.93 50.20±27.72 72.24±9.17 46.51±18.13 86.33±10.20 41.49±22.2藥物地骨皮桑白皮牡丹皮大腹皮合歡皮白鮮皮陳皮七皮飲20mg/mL 146.64±20.24 49.84±14.42 61.72±30.30 43.60±27.88 60.33±12.04 30.04±20.85 76.99±9.67 25.94±9.88 25mg/mL 146.66±20.76 43.74±22.79 48.65±29.88 43.80±26.84 27.89±9.82 20.84±14.86 75.57±13.00 13.01±15.03

2.2“七皮飲”對HaCaT細胞周期的結果

2.2.1 G0/G1期 不同濃度不同作用時間G0/G1期細胞比例，見表2。對不同濃度不同作用時間G0/G1期細胞比例（%）進行方差分析，結果顯示：不同時間組間G0/G1期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；不同濃度組間G0/G1期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同時時間和濃度之間存在交互作用（P=0.01）。

表2 不同濃度各時間G0/G1期細胞比例（±s） %

表2 不同濃度各時間G0/G1期細胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）0 65.48±2.86 67.94±2.15 77.90±2.77 6.25 73.92±3.75 82.23±3.04 85.15±3.19 12.5 85.92±2.88 85.97±2.99 89.97±2.70 25 87.87±2.77 87.93±3.49 92.17±4.02時間（h）24 48 72

時間與濃度的交互作用：各濃度組隨時間推移G0/G1期細胞比例明顯增加，各時間段隨著濃度的增加G0/G1期細胞比例明顯增加。即G0/G1期細胞比例濃度和時間具有明顯的計量反應關系。

2.2.2 G2/M期 不同濃度不同作用時間G2/M期細胞比例，見表3。對不同濃度不同作用時間G2/M期細胞比例（%）進行方差分析，結果顯示：不同時間>G2/M期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；不同濃度組間G2/M期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；同時時間和濃度之間存在交互作用（P<0.01）。

表3 不同濃度各時間G2/M期細胞比例（±s） %

表3 不同濃度各時間G2/M期細胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）12.5 5.06±0.19 4.09±0.22 4.06±0.17 25 4.27±0.16 5.52±0.20 4.36±0.21時間（h）24 48 72 0 4.72±0.17 3.79±0.15 4.57±0.17 6.25 4.76±0.15 3.37±0.17 4.67±0.20

時間與濃度的交互作用：25mg/mL濃度組隨時間推移G2/M期細胞比例先增加后下降，其它濃度組隨時間推移G2/M期細胞比例先下降后增加，其中25mg/mL濃度組在48hG2/M期細胞比例最高。

2.2.3 S期 不同濃度不同作用時間S期細胞比例，見表4。對不同濃度不同作用時間組S期細胞比例（%）進行方差分析，結果顯示不同作用時間組間S期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01），不同濃度組間S期細胞比例有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。同時時間和濃度之間存在交互作用（P<0.01）。

表4 不同濃度不同時間S期細胞比例（±s） %

表4 不同濃度不同時間S期細胞比例（±s） %

濃度（mg/mL）時間（h）24 48 72 0 35.83±1.30 28.99±1.16 24.59±1.32 12.5 12.26±0.46 26.33±1.42 6.06±0.25 25 6.43±0.25 23.40±0.86 3.24±0.15 6.25 27.27±0.86 27.92±1.39 7.74±0.33

時間與濃度的交互作用：對照組隨著時間的推移，S期細胞比例逐漸下降，其它各個濃度組隨著時間的推移，S期細胞比例先增加后下降。各個時間段，隨著濃度的增加S期細胞比例逐漸下降，其中24h段下降最快，48h段下降最緩。對照組24h S期細胞比例最高，25mg/mL濃度組72h S期細胞比例最低。

“七皮飲”抑制角質形成細胞增殖，主要表現(xiàn)為使角質形成細胞的細胞周期阻滯于G1期。實驗結果表明隨著藥物濃度的增加和藥物作用時間的延長，G0/G1期細胞比例明顯增加。另外，隨著藥物濃度的增加和藥物作用時間的延長，S期細胞比例明顯下降。

3 討論

銀屑病主要與角質形成細胞的增殖和分化異常有關，而后者又與角質形成細胞的細胞周期的改變相聯(lián)系。

在真核細胞周期進程中存在著一些關鍵的過渡點，當其受到外界壓力時會限制細胞周期的轉變，被稱為細胞周期檢測點[1]。檢測點是作用于細胞周期轉換過程的關鍵調控通路，一般認為細胞周期中存在兩個主要限制點，即G1/S限制點和G2/M限制點。

目前普遍認為角質形成細胞的細胞周期G1/S調控點異常是角質形成細胞異常增生發(fā)生的重要機制。細胞在該檢測點對各類生長因子、分裂原以及DNA損傷等復雜的細胞內、外信號的刺激下產(chǎn)生級聯(lián)信號傳導效應，決定細胞是否進行分裂、發(fā)生凋亡或是進入G0期[2]。任何一個可以引起G1/S調控點異常的因素都可以影響細胞周期的進程。在角質形成細胞異常增生的發(fā)生發(fā)展過程中多能觀察CyclinD或 CDK4的過表達和 CKI的失活[3-6]。CDK4、p21CIP1、p27KIP1 為三種細胞周期調節(jié)因子，它們均通過作用于Gl期而調節(jié)細胞的增殖與分化[7-9]。

有研究表明，銀屑病皮損中CyclinD和p21CIP1的含量比正常皮膚增高，而p27KIP1的含量卻比正常降低[10-12]。p27KIP1在銀屑病中降低可能使其抑制CDK活性的作用減弱從而導致細胞增殖。Baran等研究銀屑病患者皮損中p53的表達后發(fā)現(xiàn)，p53陽性細胞位于銀屑病患者皮損區(qū)的表皮全層，而正常皮膚和銀屑病患者無皮損區(qū)p53只在表皮基底層表達，結果表明p53可能是銀屑病形成的一個重要因素[13]。

“七皮飲”由地骨皮、桑白皮、牡丹皮、大腹皮、合歡皮、白鮮皮、陳皮等藥組成，具有清熱涼血，活血化瘀，理氣安神的功效。根據(jù)銀屑病中醫(yī)病因病機，本方君藥桑白皮、地骨皮，一氣一血，氣血兩清，清熱涼血而不傷陰，護陰液而不致戀邪；臣藥牡丹皮涼血降火，善透泄血中伏熱；合歡皮解郁安神，活血消腫；佐藥陳皮、大腹皮、白鮮皮理氣健脾，行氣寬中，而消氣滯濕阻。

本研究發(fā)現(xiàn)“七皮飲”使角質形成細胞阻滯于G1期。G1期的阻滯與細胞增殖密切相關，它是DNA修復期，使損傷的DNA在染色體分離前得到修復，不能修復者則退出增殖周期進入凋亡階段。因此“七皮飲”可通過阻斷細胞周期抑制角質形成細胞增殖，這可能是其治療銀屑病的機制。但它究竟是通過何種途徑引起細胞周期阻滯于G1期還有待于更深入的研究。

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