蔡凌云

(1.貴州省凱里市凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，貴州凱里 556011;2.四川省南充市西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院;西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室，四川南充 637002)

烏飯樹Vaccinium bracteatumThunb為杜鵑花科Erioaoeae越桔屬Vaccinium植物，據(jù)《中藥大辭典》載，烏飯樹葉具有益精氣、強筋骨、明目、止泄的功用，內(nèi)含有花青素、β-谷甾醇、熊果酸、藍黑色素(主要成分是槲皮素)、異葒草素、對羥基桂皮酸、內(nèi)消旋肌醇、α-亞麻酸、烏索酸、齊墩果酸、三十一烷及鞣質(zhì)等成分。烏飯樹葉具有促進視紅素再合成，Vp樣機能、改善血液微循環(huán)、抗?jié)儭⒖寡装Y、抗衰老等多種藥理活性［1-5］。國外學(xué)者研究其漿果的抗氧化活性［6-7］，但目前對烏飯樹葉的抗氧化性研究在國外尚未見報道，近年來，我國學(xué)者對烏飯樹葉的化學(xué)成分和分離出來的黃酮單體的抗氧化活性進行過研究［8-14］，本實驗提取烏飯樹的總黃酮類物質(zhì)并純化，進行總黃酮抗氧化性的研究，用SPSS軟件進行相關(guān)分析、差異性分析和回歸分析，為開發(fā)烏飯樹這一天然的食品抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 烏飯樹2010年5月采集于貴州省黔東南州臺江縣，經(jīng)環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院周江菊教授鑒定為杜鵑花科越桔屬植物烏飯樹。標本保存于凱里學(xué)院環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院標本室。

DPPH:日本和光純藥，供應(yīng)商:上海如吉生物技術(shù)有限公司。蘆丁(中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，純度≥98%，編號:1097-060918)。

磷酸鈉、鉬酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、乙醇等均為分析純，水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備 R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司。eppendorf Research移液器，德國 Eppendorf AG公司。UV-2102C型紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司。格蘭仕微波爐G8023CSL-K3:格蘭仕微波爐電器有限公司。低速離心機LD4-2:北京醫(yī)用離心機廠。BT124S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理和提取液制備 自然干燥的烏飯樹葉粉末分別過60目篩，置于干燥器中備用。精確稱取上述粉末50.000 g，置錐形瓶中，加80%乙醇，料液比為1︰15，微波間歇提取2次，每次100 s，微波功率320 W，合并提取液，濃縮至無醇味，上HPD-600藥用大孔吸附樹脂柱，水洗除雜質(zhì)，70% 乙醇洗脫。吸附體積流量為0.5 mL/min，洗脫體積流量為2 mL/min。洗脫液用于測定其中黃酮量和抗氧化活性實驗。

1.3.2 提取物中黃酮的測定和蘆丁標準曲線的制備 采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH比色法，在波長為510 nm測定吸光度。

精確稱取120℃減壓干燥至恒重的蘆丁標準品用乙醇溶解后，定容，得對照品液(0.5 mg/mL)。精密量取蘆丁對照品溶液 0.00、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 分別放入 1～6號10 mL量瓶中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液 0.3 mL，搖勻，放置 6 min，加4%NaOH溶液3mL，再用乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置10 min，測定吸光度。取經(jīng)稀釋定容的上述烏飯樹葉總黃酮洗脫液，如上方法測定吸光度。

1.3.3 DPPH·自由基的清除率測定 在試管里分別加入不同質(zhì)量濃度的洗脫液 2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質(zhì)量濃度做3個平行)，然后依次加入2 mL 2 mmol/L DPPH·，搖勻，在25℃水浴加熱反應(yīng)30 min，取出，測定在517 nm處的吸光度，此時為Ai。另取試管，加入2 mL蒸餾水代替樣品，測樣品的A0，另取試管，用蒸餾水代替DPPH·測定樣品本底吸光度，此時為Aj。根據(jù)下式計算對DPPH·的清除率，比較樣品和Vc的抗氧化能力。

1.3.4 對羥基自由基的清除率的測定 在試管里分別加入不同質(zhì)量濃度的洗脫液各 2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質(zhì)量濃度做3個平行)然后依次加入2 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL 6 mmol/L的水楊酸，2 mL 1 mmol/L的雙氧水混勻啟動反應(yīng)，在37℃水浴加熱30 min，510 nm處測定吸光度，此時為樣品Ai。另取試管，加入2 mL蒸餾水代替樣品，重復(fù)上述實驗，在510 nm處測定吸光度，此時為樣品A0。在試管里分別加入不同質(zhì)量濃度的提取液各2 mL(20、25、30、35、40、45 mg/L，每個質(zhì)量濃度做 3 個平行)然后依次加入2 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵，2 mL 6 mmol/L的水楊酸，2 mL蒸餾水代替雙氧水混勻，在37℃水浴加熱30 min，510 nm處測定吸光度，此時為樣品Aj。

1.3.5 抑制濃度EC50的求算 用SPSS 11.5軟件以樣品質(zhì)量濃度與抑制率作回歸分析，根據(jù)擬合方程求出抑制率為50%時所需樣品的質(zhì)量濃度，即半抑制濃度EC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標準曲線 在510 nm下測定標準品溶液的吸光值，作線性回歸，可得蘆丁質(zhì)量濃度C與吸光度A間的回歸方程為A=12.702C－ 0.020 9。

2.2 抑制濃度EC50以烏飯樹葉總黃酮質(zhì)量濃度(X)與抑制率(Y)作回歸分析。

DPPH·清除率的回歸方程為:Y=10.303+1.780X，相關(guān)系數(shù)R=0.966(P＜0.001)。

OH·清除率的回歸方程為:Y=41.336+0.228X，相關(guān)系數(shù)R=0.872(P＜0.001)。

根據(jù)回歸方程計算得烏飯樹葉總黃酮對DPPH·和OH·的 EC50分別為22.30 mg/L 和38.00 mg/L，說明烏飯樹葉總黃酮的抗氧化能力強，是良好的天然抗氧化劑。

2.3 烏飯樹葉總黃酮對DPPH·自由基的清除率 如圖1所示，質(zhì)量濃度對烏飯樹葉清除DPPH·影響極其顯著，相關(guān)系數(shù)分別達0.987，并隨總黃酮質(zhì)量濃度增大而清除率增大。分析表明，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，烏飯樹葉在黃酮質(zhì)量濃度為45 mg/L時，對DPPH·的清除率最高，與其他質(zhì)量濃度具有極顯著差異(P＜0.01)。烏飯樹樹葉總黃酮對DPPH·具有相當強的清除能，其EC50達22.30 mg/L。

圖1 對DPPH·的清除率

2.4 烏飯樹葉總黃酮對羥基自由基的清除率 如圖2所示，質(zhì)量濃度對烏飯樹葉清除OH·影響極其顯著，相關(guān)系數(shù)分別達0.872，并隨總黃酮質(zhì)量濃度增大而清除率增大。分析表明，在所選質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，烏飯樹葉在總黃酮質(zhì)量濃度為45 mg/L對OH·的清除率最高，與其他質(zhì)量濃度比具有極顯著差異(P＜0.01)。質(zhì)量濃度為40 mg/L、35 mg/L、30 mg/L時，質(zhì)量濃度變化對自由基清除率的影響沒有顯著性差異，質(zhì)量濃度為30 mg/L、25 mg/L時，質(zhì)量濃度變化對自由基的清除率的影響也沒有顯著性差異，質(zhì)量濃度為25 mg/L與20 mg/L時，質(zhì)量濃度變化對自由基的清除率的影響具有極顯著差異(P＜0.01)。烏飯樹樹葉總黃酮對OH·具有相當強的清除能，其EC50達38.00 mg/L。

圖2 對羥基自由基的清除率

3 結(jié)論和討論

3.1 在生命活動的過程中，氧化代謝反應(yīng)會產(chǎn)生各種自由基，適量自由基對細胞的分裂、生長、消炎、解毒等起積極作用。但是自由基過多或清除過慢會使生物大分子受到攻擊，加速機體的衰老進程，并誘發(fā)炎癥、惡性腫瘤、免疫失調(diào)等多種疾?。?8］。為了抑制自由基損傷，人工合成的抗氧化劑被大量應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，化學(xué)合成制品大多有毒副作用，長期攝入合成抗氧化劑可導(dǎo)致肝損傷并誘發(fā)惡性腫瘤［15］，因此從天然產(chǎn)物中尋找低毒或無毒的抗氧化有效成分具有十分重要的意義。天然黃酮、皂苷、多糖等化合物對物理、化學(xué)以及生物等因素產(chǎn)生的自由基具有清除作用，有望作為天然抗氧化劑使用。

3.2 我們通過選用清除自由基DPPH·和OH·法，對烏飯樹葉總黃酮體外抗氧化活性進行了檢測。2，2-二苯代苦味肼基(DPPH)自由基是一種合成的有機自由基。常用來研究酚類抗氧化劑的構(gòu)效關(guān)系，此法是依據(jù)DPPH在517 nm處有一強吸收和其乙醇溶液呈紫色的特性，在有自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可用分光法進行定量分析。María等［16］用DPPH法測石榴汁、維生素C、和葡萄酒的總的抗氧化能力，將清除DDPH 50%所用量定義為EC50，用來作為抗氧化能力的指標。郝曉麗等［17］用DDPH自由基清除法測定了多種植物(馬齒莧，扁蓄，車前草等)的清除自由基的能力。在測定樣品對DPPH自由基的清除能力時可通過計算EC50，TEC50(清除DDPH 50%所需用量時所用的時間)和AE(清除效率)等參數(shù)來反映抗氧化劑清除自由基反應(yīng)的動力學(xué)行為［18］。對羥基自由基的清除作用采用水楊酸法。通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH氧化水楊酸產(chǎn)生對510nm光有特征吸收的2，3-二羥基苯甲酸，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產(chǎn)物確定·OH的清除率。

3.3 我國民間有采食烏飯漿果的習(xí)慣，有些地方用于制造果醬和釀酒但是沒有形成規(guī)模，國外對于烏飯樹樹果的研究報道也有，烏飯樹提取物中以前花青素和槲皮素為代表的植物多酚類為主。近年來，通過廣泛而深入的研究，植物多酚已被稱為第7營養(yǎng)素，烏飯樹葉提取物中含有大量的植物多酚這一特點，決定了其具有很高的營養(yǎng)保健價值。我們對烏飯樹葉總黃酮體外抗氧化活性進行了檢測，并考察了其EC50，結(jié)果證實了烏飯樹葉黃酮是一種良好的天然抗氧化劑，為烏飯樹在保健食品、藥品領(lǐng)域中的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

［1］陳重明，張 寧，王 鳴.烏飯樹的民族植物學(xué)［J］.植物資源與環(huán)境，1998，7(1):45.

［2］南京新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下)［M］上海:上海人民出版社，1974:652.

［3］國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會.中華本草(精華本)［M］.上海:上?？萍汲霭嫔?，1998:1472.

［4］屠鵬飛，胡迎慶，劉江云.越桔屬植物的化學(xué)成分與開發(fā)應(yīng)用價值［J］.中草藥，1996，27(9):565-568.

［5］Cheng Chong-Ming.Ethnobotany ofthe Blackrice Tree(Vaccinium bracteaiumThunb.)［C］.The first international congress of ethnobiology，Proceedings ofethnobiology:Implications and applications［J］.Belem Press，1998:178-181.

［6］Connor A M.Variability in antioxidant activity in blueberry，and correlations among different antioxidant activity assays［J］.J Am Soc Hortic Sci，2002，127(2):238-244.

［7］Pinhero R G，Paliyath G.Antioxidant and calmodulin-inhibitory activities ofphenolic components in fruit wines and its biotechnological implications［J］.FoodBiotechnol，2001，15(3):179-192.

［8］王 立，姚惠源.烏飯樹樹葉的黃酮類成分研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19(6):989-990.

［9］李增亮，張 琳，田景奎，等.烏飯樹葉的化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2008，33(18):2087-2089.

［10］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中槲皮素的提取分離與鑒定［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2005，24(4):89-91.

［11］王 立，姚惠源，陳正行.烏飯樹樹葉中黃酮類物質(zhì)的分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定［J］.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，2007，27(3):122，124.

［12］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的抗氧化活性［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25(4):82-84，88.

［13］王 立，姚惠源，陶冠軍，等.烏飯樹樹葉中黃酮類色素的抗氧化活性［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25(4):82-84，88.

［14］魏國華，劉鐘棟，許新德，等.烏飯樹葉提取物的抗氧化能力探討［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32(12):57-59.

［15］GRICE H C.Safety evaluation of butylated hydroxyanisole from the perspective of effects on forestomach and oesophageal squamous epithelium［J］.Food and Chemical Toxicology，1988，26(8):717-723.

［16］María I.Gil，F(xiàn)rancisco A.Tomá_Barberán，Betty Hess_Pierce，Deirdre M.Holcroft，and Adel A.Kader，Antioxidant activity of pomegranate juice and its relationship with phenolic composition and pressing［J］.J Agric Food Chem，2000，48:4561-4569.

［17］郝曉麗，許申鴻，杭 瑚，等.用兩種方法評價四種食品抗氧化劑的抗氧化活性［J］.食品化學(xué)，2003，24(2)127-129.

［18］Bors S W，Van Beek T A.Screening of plant extract for antioxidant activity，a comparative study on three testing methods［J］.Photochemi Anal，2002，13(1):8.