董六一， 范一菲， 邵 旭， 陳志武

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，安徽合肥 230032;2.合肥七星醫(yī)藥科技有限公司，安徽合肥 230088)

心肌缺血再灌注損傷時心肌細胞死亡有壞死和凋亡兩種形式，其中心肌細胞凋亡在I/R后的損傷形成過程中起主導(dǎo)作用［1］。細胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展受多種基因調(diào)控，其中Bcl-2基因和Bax基因被認為與細胞凋亡關(guān)系密切［2-3］。山楂系薔薇科植物，是我國傳統(tǒng)中藥，主要有助消化作用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)［4-6］，山楂葉中提取的黃酮類化合物具有降血脂、降血壓、增加冠脈流量、保護心肌缺血、抗氧化等作用。牡荊素(vitexin)是從山楂葉中提取的有效成分，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，牡荊素對缺氧復(fù)氧心肌細胞具有明顯的保護作用［7］。本實驗在大鼠Langendorff離體心臟缺血/再灌注模型上，采用TUNEL技術(shù)及電鏡細胞超微結(jié)構(gòu)觀察相結(jié)合，并采用免疫組化方法檢測Bcl-2，Bax等相關(guān)凋亡基因的表達，研究了牡荊素對大鼠心肌缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)細胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 清潔級SpragueDawleg(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量250～280 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(皖)2005-001，實驗室飼養(yǎng)溫度:(22±3)℃。

1.2 藥品與試劑 牡荊素:合肥七星醫(yī)藥科技有限公司提供，凍干粉針，規(guī)格:10mg/瓶，批號:20041101，臨用前用生理鹽水(NS)配制成所需濃度;水合氯醛:中國上海白鶴化工廠，批號:990510;小鼠單克隆抗體Bcl-2，Bax:美國SantaCruz公司產(chǎn)品，購自北京中山生物科技股份有限公司;TdT介導(dǎo)的原位末端標(biāo)記法檢測細胞凋亡試劑盒:北京中山生物科技股份有限公司產(chǎn)品;液體DAB酶底物顯色試劑盒:北京中杉生物科技股份有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.3 儀器與設(shè)備 MDF-192 ULTRA-LOW TEMPETATURE FREEZER(超低溫冰箱):SANYO Electric CO.Ltd.Made in Japan;RM2135型石蠟切片機:德國Leica公司產(chǎn)品;數(shù)碼成像系統(tǒng):日本NIKON公司產(chǎn)品;BK1000光學(xué)顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠;Eclipse80i免疫熒光顯微鏡:日本Nikon公司產(chǎn)品;JEM-100SX透射電子顯微鏡:日本電子株式會社產(chǎn)品。

2 方法

2.1 離體大鼠缺血缺氧再灌注損傷模型的制備［8］腹腔注射(ip)10%水合氯醛將大鼠輕度麻醉，開胸后迅速取出心臟置于4℃氧飽和的KH液中，立即經(jīng)主動脈插管懸掛于Langendorff裝置上，灌流液為38℃氧飽和的KH液［灌流液(mmol/L)組成(NaCl:105.7，KCL:5.36，CaCl2:1.28，MgCl2.6H2O:1.084，KH2PO4:1.18，NaHCO3:18，GS:11，pH:7.4 ±0.5)］。在實驗過程中，離體心臟被隨機分為3組:(1)對照組:僅以KH液持續(xù)灌流90 min;(2)I/R組:穩(wěn)定灌流30 min，停止灌流30 min，然后再灌注30 min;(3)牡荊素組:預(yù)平衡灌流10 min，然后再用含100 μmol/L的KH液灌流20 min，其他處理與I/R組相同。再灌注結(jié)束后迅速用利刃取心尖部缺血心肌1 mm×1 mm×1 mm的組織塊置于2.5%戊二醛溶液(4℃)中前固定，行電鏡檢查;然后取左心室心尖部組織置于10%甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，行TUNEL檢查及免疫組化檢測。

2.1.1 TUNEL法檢側(cè)細胞調(diào)亡 標(biāo)本常規(guī)10%中性緩沖福爾馬林固定，石蠟包埋、切片。切片常規(guī)脫蠟入水。新鮮配制3%H2O2，室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2 min，洗3次，標(biāo)本片加入TBS以1:100新鮮稀釋的Proteinase K，37℃消化15 min，加標(biāo)記緩沖液20 μL/片，以保持切片濕潤。按每張切片取TdT和DIG-dUTP各1μl，加入18 μL標(biāo)記緩沖液中，混勻，甩去切片上多余的液體后加標(biāo)記液20 μL/片，置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h。TBS洗2 min，洗3次，加封閉液50 μL/片，室溫30 min，甩掉封閉液，不洗，用封閉液1:100稀釋生物素化抗地高辛抗體，50 μL/片加至標(biāo)本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30 min。TBS洗2 min，洗3次，用 TBS 1:100 稀釋 SABC，取1 mL TBS 加 SABC 10 μL，混勻后加至切片，37℃反應(yīng)30 min，TBS洗5 min，洗4次，DAB顯色，顯色30 min左右，水洗，蘇木素輕度復(fù)染，TBS及蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

結(jié)果判定:細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。將Tunel切片于光鏡下400倍放大，通過圖像分析儀每張切片隨機選擇10個視野，測定陽性染色的平均光密度與陽性細胞百分比(指陽性細胞占視野中所有細胞數(shù)的百分比)，計算細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI):AI(%)=平均光密度×陽性細胞百分比×100%。

2.1.2 Bax，Bcl-2基因蛋白免疫組化檢測 標(biāo)本常規(guī)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。石蠟切片脫蠟至水，用 PBS(0.01 mol/L pH 7.4)沖洗3 次，每次5 min，每張切片加50 μL 0.3% 的過氧化氫甲醇溶液室溫處理30 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化酶。PBS沖洗3次，每次5 min，每張切片加50 μL正常非免疫動物血清，室溫處理20 min，吸去多余的液體。每張切片加50 μL第一抗體，室溫濕盒孵育60 min，PBS沖洗3次，每次5 min，每張切片加50 μL生物素標(biāo)記的第二抗體，室溫濕盒孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，每張切片加50 μL鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫濕盒孵育10 min，PBS沖洗3次，每次5 min，每張切片加100 μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。以PBS代替一抗進行反應(yīng)作陰性對照。

Nikon 80i免疫熒光顯微鏡下觀察，并對每組切片隨機取10個不重疊的視野拍照。采用捷達801D形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(Version 6.0)對所得照片進行計算機圖像分析，統(tǒng)一參數(shù)設(shè)定保持基線一致，其陽性追蹤點為表達于胞漿或胞膜的棕黃色定位。計算切片各視野陽性點面積總和及光密度均值，以陽性點面積總和/陽性點光密度均值表示陽性表達強度。

2.1.3 電鏡觀察凋亡細胞的超微結(jié)構(gòu) 取心尖部缺血心肌1 mm×1 mm×1 mm的組織塊置于2.5%戊二醛溶液(4℃)中前固定，PBS液沖洗，1%鋨酸后固定(4℃)1 h，PBS液沖洗，梯度脫水，環(huán)氧樹脂滲透(Epon 812)，平板包埋36h，切片50～70 nm，醋酸雙氧鈾和檸檬鉛雙染色，H600透射電鏡下觀察。

2.2 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用隨機區(qū)組設(shè)計的單因素方差分析(ANOVAO)，檢驗顯著性水平定于P＜0.05。

3結(jié)果

3.1 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡的影響 模型組細胞凋亡指數(shù)顯著高于正常對照組(P＜0.01)。牡荊素(100、50、25 μmol/L)組與 I/R 組比較，細胞凋亡指數(shù)顯著降低(P＜0.01)。提示牡荊素可以通過抑制MI/R大鼠心肌細胞凋亡，從而起到保護缺血/再灌注心肌損傷的作用，見表1。

3.2 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表達的影響 Bax，Bcl-2蛋白陽性反應(yīng)為黃色或棕黃色顆粒，彌漫性分布，定位于胞膜、胞漿。正常對照組有少量Bax或Bcl-2蛋白表達，模型組Bax或Bcl-2蛋白表達較正常對照組顯著增加(P＜0.01，P＜0.05)。與模型組比較，牡荊素組Bax蛋白表達顯著減少(P＜0.01)。與模型組比較，牡荊素組對上述兩種蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，Bcl-2/Bax的比值明顯上升，抑制了細胞凋亡，造成細胞凋亡指數(shù)下降。結(jié)果見表2。

表1 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡指數(shù)的影響(± s，n=8)

表1 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡指數(shù)的影響(± s，n=8)

注:與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 劑 量/(μmol/L) Apoptosis Index(%)對照組 —1.23 ±0.17模型組 — 23.56±4.58△△牡荊素 100 12.79 ±3.21＊＊50 14.34 ±2.98＊＊25 17.62 ±3.43*葛根素 120 16.89 ±4.61*

表2 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表達的影響(± s，n=8)

表2 牡荊素對離體大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞凋亡基因Bax，Bcl-2蛋白表達的影響(± s，n=8)

注:與對照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P＜0.01。

Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax ratio對照組 —組 別 劑 量/(μmol/L)1.08 166.60 ±37.73 154.84 ±66.52 1.08模型組 — 273.08±117.87△ 421.02 ±106.92△△ 0.65牡荊素 100 386.50±87.86* 227.07 ±86.72＊＊ 1.70 50 299.95 ±97.83 269.35 ±73.58＊＊ 1.11 25 275.43 ±127.20 300.49 ±102.09* 0.92葛根素 120 304.77 ±117.80 282.68 ±63.95＊＊

3.3 牡荊素對電鏡觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)的影響 電鏡下對照組心肌肌絲走行規(guī)整，無明顯溶解破壞;I/R組心肌細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，細胞核有異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象;肌膜破損，肌原纖維溶解斷裂、肌絲排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，明暗帶和Z線基本消失;線粒體腫脹，大小不等，嵴變平甚至消失，空泡形成，部分線粒體固縮，未見到典型的凋亡小體。牡荊素組(100、50 mol/L)心肌細胞損傷明顯減輕，細胞輕度水腫，肌膜完整，肌纖維排列規(guī)則，明暗帶分明，Z線結(jié)構(gòu)清晰，但Z線明顯增寬;線粒體豐富，嵴密集，排列規(guī)則，無明顯線粒體腫脹與空泡形成。提示牡荊素可減輕缺血再灌注損傷對大鼠心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，從而對心肌產(chǎn)生保護作用。見圖1。

圖1 牡荊素對電鏡觀察凋亡細胞超微結(jié)構(gòu)的影響(×10 000)

4討論

心肌細胞凋亡是心肌缺血早期心肌細胞死亡的主要原因，而缺血-再灌注損傷則加速加重其凋亡［9］。抑制細胞凋亡則能顯著縮小缺血-再灌注所致心肌梗死的面積［10］。本實驗結(jié)果證實，牡荊素可顯著減少大鼠離體心臟缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，其抗凋亡作用可能是牡荊素保護心肌的重要機制之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，許多基因參與介導(dǎo)細胞凋亡信號的調(diào)控過程。其中，Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡過程中起到重要的加速和延緩作用［11］。Bcl-2基因是一個重要的凋亡抑制基因，其蛋白通過影響線粒體釋放細胞色素C的過程來調(diào)節(jié)細胞凋亡［12-13］。Bax基因是Bcl-2基因家族中的一個促凋亡基因，是Bcl-2基因的拮抗基因，主要表達于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它通過和Bcl-2形成異二聚體而抑制Bcl-2的功能，并有研究認為Bcl-2/BAX比值是凋亡調(diào)控的指標(biāo)之一，Bcl-2/BAX比值的高低是決定對細胞凋亡發(fā)揮何種作用的關(guān)鍵因素［14］。本研究結(jié)果顯示，牡荊素各劑量組與模型組相比較，心肌中Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達下降，但其與對照組相比，Bax蛋白表達仍稍高，由此推測牡荊素能通過促使Bcl-2恢復(fù)正常，抑制BAX升高，提高Bcl-2/Bax比值，從而抑制心肌缺血再灌注所致的心肌細胞凋亡。心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細胞損傷最直觀的指標(biāo)，心肌細胞中線粒體對缺血缺氧十分敏感，是決定細胞由可逆到不可逆改變的關(guān)鍵細胞器，線粒體彌漫性腫脹，膜破裂、嵴溶解消失，空泡形成等均是缺血造成的損傷［15］。在心肌細胞凋亡時，線粒體結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生明顯變化，且與心肌細胞凋亡顯著相關(guān)［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，牡荊素給藥組心肌損傷程度較模型組(I/R)明顯改善，明顯減輕心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，從而對心肌產(chǎn)生保護作用。以上實驗結(jié)果證實，牡荊素通過上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，穩(wěn)定線粒體膜，阻止心肌細胞凋亡的發(fā)生，減輕心肌細胞損傷，從而對心肌細胞起保護作用。

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