姚麗梅， 劉 瑤， 段 啟*

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520;2.廣東高校南藥資源保護(hù)與利用工程技術(shù)開(kāi)發(fā)研究中心，廣東廣州 510520)

夏天無(wú)為罌粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens(Thunb.)Pers.的干燥塊莖，具有活血止痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)除濕的功效，臨床主要用于中風(fēng)偏癱、頭痛、跌撲損傷、風(fēng)濕痹痛、腰腿疼痛［1］。夏天無(wú)的主要活性成分為生物堿，注射用夏天無(wú)總堿是從夏天無(wú)中提取的總生物堿制成的凍干粉針劑，我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)注射用夏天無(wú)總堿對(duì)沙鼠全腦缺血再灌注損傷具有治療作用［2］。為進(jìn)一步研究注射用夏天無(wú)總堿對(duì)腦缺血的治療作用，本實(shí)驗(yàn)采用改良的大鼠大腦中動(dòng)脈線栓模型，研究其對(duì)大鼠局灶性腦缺血的治療作用，為臨床研究提供充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 注射用夏天無(wú)總堿(凍干粉針)，2 mg/瓶，由某制藥有限公司提供，批號(hào)050508，試驗(yàn)前用0.9%氯化鈉注射液配至所需濃度;燈盞細(xì)辛注射液，云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，10 mL/支(含總黃酮45 mg)，批號(hào)20050322。

1.2 動(dòng)物 雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(320±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào):SCXK(滬)2003-0003。

1.3 儀器 LIBROR AEL-160電子分析天平(日本島津公司);LXJ-IIB低速大容量離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);UV-260紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);LEICA RM2135切片機(jī)、LEICA HI1210漂片機(jī)、LEICA HI1220烤片機(jī)、LEICA EG1160包埋機(jī)(德國(guó)LEICA公司);YG-12T生物組織電腦脫水機(jī)(湖北陽(yáng)光醫(yī)療有限責(zé)任公司)。

1.4 試劑 SOD、MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20060217、20060411。

1.5 方法 取大鼠60只，隨機(jī)分為6組，即注射用夏天無(wú)總堿高、中、低劑量組(劑量分別為 0.2、0.1、0.05 mg/kg)，燈盞細(xì)辛注射液組(劑量為9.0 mg/kg)，模型對(duì)照組和假手術(shù)組，每組10只。參照文獻(xiàn)方法［3-4］，并加以改進(jìn)制備大鼠大腦中動(dòng)脈線栓模型。用10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定，常規(guī)消毒皮膚，頸部正中切開(kāi)，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。沿頸內(nèi)動(dòng)脈向下分離出翼腭動(dòng)脈，于近分叉處結(jié)扎之。用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈上(近頸總動(dòng)脈分叉處)剪一切口，將一魚(yú)線沿頸內(nèi)動(dòng)脈緩慢插入至大腦中動(dòng)脈口，略感阻力時(shí)停止，插入長(zhǎng)度約(18±0.5)mm，結(jié)扎固定魚(yú)線。結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈近心端，取下動(dòng)脈夾，恢復(fù)頸外動(dòng)脈血流。整個(gè)手術(shù)過(guò)程注意避免損傷迷走神經(jīng)?？p合肌肉皮膚，回籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組大鼠分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈，并結(jié)扎翼腭動(dòng)脈，但不插魚(yú)線阻斷大腦中動(dòng)脈。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡及癲癇發(fā)作者不計(jì)入試驗(yàn)。阻斷大腦中動(dòng)脈后即刻經(jīng)尾靜脈注射給藥，給藥容量均為2 mL/kg體質(zhì)量，模型對(duì)照組和假手術(shù)組給等容量的生理鹽水。

1.5.1 神經(jīng)癥狀評(píng)分 參照文獻(xiàn)方法［5-6］，按受損程度擬定神經(jīng)癥狀評(píng)分等級(jí)。0級(jí):無(wú)神經(jīng)損傷癥狀;Ⅰ級(jí):不能完全伸展左側(cè)前爪;Ⅱ級(jí):不能完全伸展左側(cè)前爪，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;Ⅲ級(jí):不能完全伸展左側(cè)前爪，向左側(cè)傾倒;Ⅳ級(jí):不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。按上述標(biāo)準(zhǔn)，分別于阻斷大腦中動(dòng)脈后6 h及24 h采用單盲法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分。

1.5.2 腦組織梗死范圍測(cè)定 末次評(píng)分后，將大鼠斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，生理鹽水洗凈，濾紙吸盡水分，然后冠狀切4刀，共5片。第二腦片留出供病理學(xué)檢查，將其余4腦片置1%TTC磷酸鹽緩沖液中37℃避光溫孵10 min，洗去染色液，再用10%中性甲醛溶液固定24 h，取出觀察拍照并稱定質(zhì)量，然后切取梗死區(qū)稱定質(zhì)量，以“重量求面積法”計(jì)算梗死組織質(zhì)量占總腦中的百分比作為梗死面積。

1.5.3 血清SOD、MDA水平測(cè)定 末次評(píng)分后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，按試劑盒操作方法，比色法測(cè)定血清SOD活性、MDA水平。

1.5.4 組織病理學(xué)檢查 第二腦片10%中性甲醛溶液固定，乙醇逐級(jí)脫水，HE染色，光鏡觀察大鼠腦組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)神經(jīng)癥狀評(píng)分的影響 給藥后6 h，注射用夏天無(wú)總堿低劑量組大鼠神經(jīng)損傷癥狀顯著改善;給藥后24 h，注射用夏天無(wú)總堿高、中、低劑量組大鼠神經(jīng)癥狀均顯著改善，見(jiàn)表1。

表1 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血神經(jīng)損傷癥狀的影響 (n=10)

2.2 對(duì)梗死范圍的影響 注射用夏天無(wú)總堿高、中劑量組大鼠腦梗死質(zhì)量及梗死范圍均明顯減小，見(jiàn)表2。

表2 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織梗死范圍的影響 ( ±s，n=10)

表2 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織梗死范圍的影響 ( ±s，n=10)

與模型對(duì)照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01(下同)。

組別 劑量/(mg/kg)梗死質(zhì)量×10－2/g梗死范圍/%假手術(shù)組 生理鹽水 — —模型對(duì)照組 生理鹽水 21.20±9.62 17.43±7.08注射用夏天無(wú)總堿 0.2 9.49 ±3.76＊＊ 7.99 ±3.60＊＊注射用夏天無(wú)總堿 0.1 10.43 ±6.43* 9.21 ±5.48*注射用夏天無(wú)總堿 0.05 19.94 ±12.90 16.57 ±10.47燈盞細(xì)辛注射液組 9.0 9.05 ±3.13＊＊ 8.00 ±4.01＊＊

2.3 對(duì)血清SOD、MDA的影響 注射用夏天無(wú)總堿高、中、低劑量組大鼠血清SOD活性顯著升高;注射用夏天無(wú)總堿高、中劑量組大鼠血清MDA水平明顯下降，見(jiàn)表3。

表3 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血血清SOD、MDA 水平的影響 (±s，n=10)

表3 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血血清SOD、MDA 水平的影響 (±s，n=10)

組別 劑量/(mg/kg)SOD/(U/mL)MDA/(nmol/mL假手術(shù)組 生理鹽水 332.64 ±38.60＊＊ 4.21 ±0.40)＊＊模型對(duì)照組 生理鹽水 260.18 ±21.13 6.09 ±1.23注射用夏天無(wú)總堿 0.2 340.62 ±42.36＊＊ 4.21 ±0.72＊＊注射用夏天無(wú)總堿 0.1 323.49 ±46.89＊＊ 4.43 ±0.67＊＊注射用夏天無(wú)總堿 0.05 330.81 ±43.71＊＊ 5.20 ±1.27燈盞細(xì)辛注射液組 9.0 324.65 ±44.50＊＊ 4.20 ±0.73＊＊

2.4 組織病理學(xué)檢查結(jié)果 模型對(duì)照組大鼠腦組織充血，部分出現(xiàn)小灶出血，局部神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，灰質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)輕度核固縮和輕度細(xì)胞壞死、消失，白質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)纖維束輕度液化壞死。假手術(shù)組部分大鼠腦組織輕度充血，其余未見(jiàn)明顯改變。注射用夏天無(wú)總堿高劑量組部分大鼠腦組織輕度充血，少數(shù)大鼠灰質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)細(xì)胞輕度排列紊亂，部分神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮和輕度細(xì)胞壞死消失，白質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)纖維束輕度液化壞死。注射用夏天無(wú)總堿中、低劑量組大鼠腦組織輕度充血，部分大鼠局部神經(jīng)細(xì)胞輕度排列紊亂，局部膠質(zhì)細(xì)胞輕度核固縮和壞死消失，白質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)纖維束輕度液化壞死。注射用夏天無(wú)總堿各劑量組腦組織病變均比模型對(duì)照組輕，其中高劑量組病變最輕。燈盞細(xì)辛注射液組部分大鼠腦組織輕度充血，少數(shù)大鼠灰質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)細(xì)胞輕度排列紊亂，部分神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮和輕度細(xì)胞壞死消失，白質(zhì)區(qū)局部神經(jīng)纖維束輕度液化壞死。組織病理學(xué)半定量結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 注射用夏天無(wú)總堿對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織病理檢查半定量結(jié)果

3 討論

缺血性腦血管疾病是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的高發(fā)病之一，其發(fā)病兇險(xiǎn)，致殘、致死率高，可導(dǎo)致嚴(yán)重的遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，影響患者的預(yù)后和功能恢復(fù)，嚴(yán)重危害人們的健康。臨床上腦缺血多見(jiàn)于大腦中動(dòng)脈，因此使用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓法制備腦缺血模型，能較真實(shí)地模擬臨床狀態(tài)，且該模型操作簡(jiǎn)便，無(wú)需開(kāi)顱，缺血部位較恒定，腦梗死范圍差異較小，被廣泛用于研究藥物腦保護(hù)作用［7-12］。既往已有研究報(bào)道［13］夏天無(wú)總堿口服對(duì)腦缺血/再灌注損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制NOS活性、提高SOD活性、減少神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本試驗(yàn)采用大鼠大腦中動(dòng)脈線栓模型觀察注射用夏天無(wú)總堿對(duì)腦缺血的治療作用，通過(guò)改變劑型及給藥途徑，給藥劑量大為降低，可減弱夏天無(wú)總堿中個(gè)別成分對(duì)機(jī)體潛在的不良作用。

自由基在缺血缺氧性腦損傷的病理生理機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用，正常生物體內(nèi)自由基生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，腦缺血時(shí)，大量的自由基生成，使腦內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化作用加強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞及細(xì)胞屏障損害，神經(jīng)元壞死或凋亡，引起和加重缺血腦組織水腫［14］。SOD是體內(nèi)主要的自由基清除劑，可催化超氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過(guò)氧化氫和氧，而超氧自由基的產(chǎn)生是其他自由基產(chǎn)生和增殖的關(guān)鍵步驟。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，MDA水平間接反映了組織中自由基含量及脂質(zhì)過(guò)氧化程度。因此，測(cè)定這些物質(zhì)的活性或含量變化可以間接反映藥物抗腦缺血損傷作用的強(qiáng)弱。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，注射用夏天無(wú)總堿能顯著改善局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)損傷癥狀，減小梗死范圍，降低血清MDA含量，增強(qiáng)血清SOD活性，改善缺血腦組織病理變化，對(duì)局灶性腦缺血損傷具有明顯的治療作用。

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