李石軍， 張 玉， 王凱平， 郭 丹， 辜 明

(1.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，湖北 武漢 430030;2.華中科技大學(xué) 同濟(jì)醫(yī)學(xué)院 協(xié)和醫(yī)院 藥劑科，湖北武漢 430030)

香菇Lentinus edodes為擔(dān)子菌綱傘形科真菌，是世界上第二大食用菌。香菇多糖是香菇中最重要的一種生物活性物質(zhì)，作為一種免疫促進(jìn)劑，在20世紀(jì)60年代已引起人們廣泛的興趣。現(xiàn)代研究表明:香菇多糖具有抗病毒、抗腫瘤，調(diào)節(jié)免疫力、降血糖、抗氧化等功能。與傳統(tǒng)中草藥相比，香菇多糖通過增強(qiáng)機(jī)體免疫力間接殺死腫瘤細(xì)胞，因而毒副作用極小。在臨床上香菇多糖主要用于抑制和防止胃癌、鼻咽癌、直腸癌、乳腺癌和慢性粒細(xì)胞病的術(shù)后微轉(zhuǎn)移［1-4］。

目前，香菇多糖的提取大多采用水提-醇沉法［5］，得到的粗多糖雜質(zhì)較多，后期純化較麻煩，且分子量較小，抗腫瘤活性較差。有文獻(xiàn)報(bào)道［6］，分子量在 4.0 ×105Da到 8.0 ×105Da的香菇多糖抗腫瘤活性較高。而堿提-醇沉法能得到分子量較大的香菇多糖，本實(shí)驗(yàn)以香菇子實(shí)體為原料，堿提-醇沉法提取粗多糖，正交試驗(yàn)［7-8］對(duì)香菇多糖的堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化，粗多糖經(jīng)脫色，去蛋白，超濾后得到分子量在4.0×105Da以上的均一香菇多糖組分，為以后的結(jié)構(gòu)研究及藥理藥效研究打下了基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)原料、試劑和儀器

香菇子實(shí)體(產(chǎn)自湖北房縣)，醫(yī)用酒精，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，其它試劑均為分析純，電磁爐，Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，722s型可見光分光光度計(jì)(上海精密儀器有限公司)，F(xiàn)luka Dextran Standard系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(瑞士Fluka公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 香菇粗多糖的提取 經(jīng)水提過的香菇子實(shí)體再用氫氧化鈉提取，堿提后用5 mol/L的醋酸調(diào)pH到7，離心棄去沉淀，上清液濃縮后醇沉得到粗多糖。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化香菇多糖堿提工藝 選取提取溫度、堿的濃度、提取時(shí)間3個(gè)因素，以多糖提取率(提取率/%=100×香菇粗多糖的質(zhì)量/香菇子實(shí)體的質(zhì)量)為考察指標(biāo)進(jìn)行3因素4水平的正交試驗(yàn)，對(duì)香菇粗多糖的堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化。見表1。

表1 因素與水平

根據(jù)表1所列試驗(yàn)因素和水平，選用L16(45)正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定堿提香菇粗多糖的最優(yōu)工藝，采用苯酚-硫酸法測定糖量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，見表3。

從極差R的結(jié)果來看，初步得出影響多糖提取率的主次順序?yàn)锽＞C＞A，因素B有顯著性影響，因素A和C沒有顯著性影響。根據(jù)正交試驗(yàn)各因素的影響順序如下:A1＞A4＞A3＞A2，B1＞B2＞B3＞B4，C4＞C3＞C2＞C1。因此可初步確定香菇多糖堿提工藝的最佳條件為A1B1C4，即提取溫度為35℃，堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，提取時(shí)間為24 h。

考慮到空白項(xiàng)的偏差平方和較大，為了提高檢驗(yàn)的靈敏度和精確度，將檢驗(yàn)水平取為a=0.1，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行方差分析。從方差分析結(jié)果可知，堿的濃度是影響結(jié)果的主要因素，對(duì)多糖提取率有顯著性影響;提取溫度和提取時(shí)間對(duì)結(jié)果沒有顯著性影響。

表2 堿提香菇多糖L16(45)正交試驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

考慮到溫度對(duì)多糖得率影響不大，因此本實(shí)驗(yàn)選取在室溫條件下提取粗多糖，因此確定香菇粗多糖的堿提條件為:提取溫度為25℃，堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，提取時(shí)間為24 h。

2.3 香菇粗多糖的純化 采用脫色和超濾的方法對(duì)粗多糖進(jìn)行純化，見表4。

表4 H2O2脫色實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示0.5%H2O2不能達(dá)到脫色和除蛋白效果，而1.8%和2.8%的H2O2能較好達(dá)到脫色和除蛋白的效果。考慮到較高濃度的H2O2會(huì)對(duì)多糖大分子產(chǎn)生破壞作用，因而本實(shí)驗(yàn)采用1.8%H2O2對(duì)粗多糖進(jìn)行脫色。

超濾對(duì)脫色后粗多糖進(jìn)一步純化，超濾收集的樣品經(jīng)凍干后得到白色絮狀精制香菇多糖。

2.4 糖的測定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用苯酚-硫酸法［9］測定糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以葡萄糖為對(duì)照品制備糖定量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程:A=12.542 9C－0.015 0，R2=0.999 0，C:mg/mL。

2.4.2 精制香菇多糖糖量的測定 采用苯酚-硫酸法測定超濾后樣品的糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果見表5。

表5 精制多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表5可得超濾后所得產(chǎn)品的平均糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.00%，RSD 為 0.58%。

2.5 分子量測定(高效凝膠色譜法)

2.5.1 色譜條件 色譜柱:PL aquagel-OH MIXED(300 mm×7.5 mm，8 μm)。流動(dòng)相:0.05 mol/LNa2SO4;體積流量:1 mL/min;標(biāo)準(zhǔn)品:葡聚糖-T系列;進(jìn)樣體積:30 μL;檢測器:示差折光檢測器;柱溫:35℃。

2.5.2 分子量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，0.05 mol/L Na2SO4為流動(dòng)相，通過GPC軟件，保留時(shí)間(min)為橫坐標(biāo)，分子量(Da)為縱坐標(biāo)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程:x為保留時(shí)間，單位min;y為分子量，單位Da。

2.5.3 精制香菇多糖的分子量色譜圖 采用GPC專用軟件繪制各樣品的示差色譜圖，見圖1。其中縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度(nR2u)，橫坐標(biāo)表示保留時(shí)間(min)。根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過GPC軟件即可計(jì)算出各洗脫峰對(duì)應(yīng)的分子量。

圖1 超濾法所得產(chǎn)品色譜圖

圖1所示的保留時(shí)間為7.356 min，樣品的重均分子量Mw:6.054×105Da。由上圖可看出樣品的分離純化效果好，干擾組分少，純度高，可認(rèn)為是均一分子量的香菇多糖。

2.6 紫外掃描 以0.1 mol/L的氫氧化鈉為溶劑，將多糖樣品配制成1 mg/mL的溶液。將上述樣品溶液在200～400 nm波長處進(jìn)行紫外掃描。見圖2。

圖2 香菇多糖紫外掃描圖

從紫外掃描圖可以看出，210 nm波長處的吸收峰為多糖類物質(zhì)的特征吸收峰;此外，在280 nm以及260 nm處沒有吸收峰，表明樣品中不含蛋白質(zhì)和核酸［10］。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用堿提-醇沉法從小冬菇中提取香菇粗多糖，香菇子實(shí)體先經(jīng)水提處理，棄去水提液，然后再用堿提，得到的粗多糖顏色較淺，色素等雜質(zhì)較少，為后續(xù)的純化工作減輕了負(fù)擔(dān)。由于分子量大的香菇多糖水溶性差，不易由水提-醇沉法得到，因此采用堿提-醇沉法。并為得到抗腫瘤活性較好的香菇多糖提供了保證。

通過正交試驗(yàn)對(duì)堿提工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳提取條件為:提取溫度為25℃，堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，提取時(shí)間為24 h。

香菇粗多糖的純化采用H2O2脫色和超濾法分離，得到的香菇多糖經(jīng)糖定量測定、分子量色譜圖和紫外掃描分析，純化后的香菇多糖為均一組分多糖，不含蛋白質(zhì)和核酸。

因此本實(shí)驗(yàn)采用堿提-醇沉法提取分子量在4.0×105Da以上香菇多糖的工藝是可行的，且純化工藝簡單、有效，為以后對(duì)香菇多糖的結(jié)構(gòu)分析和藥理藥效研究奠定了基礎(chǔ)。

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