王建明， 鄒 恬， 張媛媛， 范 寧

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

紅花系菊科紅花屬植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花，為活血化瘀中藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)中用于預(yù)防和治療冠心病、心肌梗死和腦血栓等中老年疾病。研究表明，紅花的主要成分是紅花黃色素［1-2］，紅花黃色素的主要成分為羥基紅花黃色素A(HSY A)，它具有抗凝、抗缺氧、降血壓、改善心腦血管供血不足等作用，臨床可用于防治心肌缺血腦缺血、冠心病、腦血栓等疾?。?-6］。血漿蛋白結(jié)合率是藥物體內(nèi)重要參數(shù)之一，影響藥物在體內(nèi)的分布、排泄和代謝速率，對藥物消除半衰期也有影響，與藥物藥理作用強(qiáng)度關(guān)系密切［7］。本實(shí)驗(yàn)在已進(jìn)行HSY A在家兔體內(nèi)藥動學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對其血漿蛋白結(jié)合率的進(jìn)行測定，目的是評價HSY A與血漿蛋白的結(jié)合狀況，確定HSY A的血漿蛋白結(jié)合率以便為HSY A的人體藥動學(xué)研究奠定基礎(chǔ)，為紅花黃色素粉針劑在臨床上的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器 Waters 600高效液相色譜儀;檢測器:Wters 2487;Empower色譜工作站;Diamonsil C18柱(迪馬公司);高速冷凍離心機(jī)KDC-160HR(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);超濾離心管(美國MILLIPORE);AG135型電子天平(瑞士METTLERTOLEDO公司);XW-80A旋渦混合器(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

1.1.2 試劑與藥品 HSY A對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:111637-200503);紅花凍干粉針劑(哈爾濱三精制藥有限公司提供，批號:050528);甲醇、異丙醇、磷酸(購于哈爾濱化學(xué)試劑采購供應(yīng)站，分析純);乙腈、甲醇(美國產(chǎn)，色譜純);氯化鈉注射液(由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院提供);超純水(自制)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 大耳白家兔(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP中心提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取HSY A對照品1 mg，置5 mL量瓶中，用水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的HSY A對照品溶液備用。

1.2.2 注射劑溶液的制備 精密稱取紅花粉針劑粉末120 mg，用生理鹽水溶解，配制成質(zhì)量濃度為55.0 mg/mL的HSY A生理鹽水溶液備用。

1.2.3 含量測定色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);流動相:甲醇-乙腈-0.2%磷酸水溶液(35∶2∶63);體積流量:1 mL/min;波長:403 nm;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.2.4 血漿樣品的處理 處理方法為固-液萃取法。先對萃取柱進(jìn)行活化和平衡，依次用1 mL水、1 mL異丙醇、1 mL甲醇、3 mL蒸餾水反相沖洗，再以1 mL蒸餾水正向沖洗，最后壓出全部液體。

圖1 羥基紅花黃色素A色譜圖

取100 μL 血漿樣品加水100 μL，渦旋混和30 s后上樣，以1 mL水沖洗棄去，再以1 mL甲醇洗脫后收集并定容至1 mL，待測。

1.2.5 色譜條件專屬性的考察 在1.2.3項(xiàng)的色譜條件下，依次進(jìn)樣(空白血漿、羥基紅花黃色素A對照品溶液、血漿樣品溶液、血漿樣品+對照品溶液)，羥基紅花黃色素A的保留時間在7 min左右，分離效果良好，空白血漿無干擾，見圖1。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 在0.5 mL空白血漿中加入0.5 mL一系列濃度的對照品溶液，使血漿中HSY A 質(zhì)量濃度分別為 10、50、100、150、200、250 μg/mL，渦旋混合1 min，按照上述血漿樣品處理方法處理后，經(jīng)高效液相方法分析測定。以血漿樣品中HSY A的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=13 901X+3 572.6(r=0.999 9)，線性范圍為 10 ～250 μg/mL，線性關(guān)系良好。

1.2.7 方法學(xué)回收率的考察 取空白家兔血清3份，加入不同濃度的HSY A對照品溶液，分別配制成低50 μg/mL、中100 μg/mL、高200 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度的血漿樣品，渦旋混合1 min，按照上述血漿樣品處理方法處理后，經(jīng)高效液相方法分析測定各5次，峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，以HSY A的測得量/加入量×100%計算回收率(%)。

得到平均回收率及RSD值的結(jié)果分別為(94.55 ±2.105 3)%、2.23%;(94.75 ±0.750 4)%、0.79%和(95.34 ±0.748 3)%、0.78%(n=5)。

1.2.8 方法學(xué)精密度的考察 取空白家兔血清3份，加入不同濃度的HSY A對照品溶液，分別配制成低50 μg/mL、中100 μg/mL、高200 μg/mL 3 個質(zhì)量濃度的血漿樣品，渦旋混合1 min，按照上述血漿樣品處理方法處理后，對不同質(zhì)量濃度同一樣品溶液1日內(nèi)各測定5次，5日內(nèi)每日各測定1次，計算不同質(zhì)量濃度的日內(nèi)、日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度為 2.83%、0.80%、0.78%，日間精密度為2.06%、0.71%、0.90%(n=5)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 血漿蛋白結(jié)合率的測定與計算 按照低(5 mg/kg)、中(10 mg/kg)、高(20 mg/kg)3 個劑量，分別吸取一定量的上述注射劑溶液(55.0 mg/mL)，3只家兔同時進(jìn)行耳緣靜脈注射給藥，并于給藥后15 min時間點(diǎn)進(jìn)行耳緣靜脈取血5 mL，置肝素化離心管中，20℃，離心15 min(3 000 r/min)，①取血漿0.5 mL，置冰箱冷凍保存，待測。②另取血漿0.5 mL，置超濾離心管中，4℃，離心15 min(7 500 r/min)［8］，取超濾液 100 μL，按 1.2.4 項(xiàng)下方法處理后，經(jīng)高效液相方法分析測定，按以下公式計算藥物的血漿蛋白結(jié)合率。

血漿蛋白結(jié)合率(%)=［1－(②藥物質(zhì)量濃度/①藥物質(zhì)量濃度)］×100%

2.2 數(shù)據(jù)與結(jié)果 羥基紅花黃色素A低、中、高3個劑量水平的結(jié)合率分別為77.22%、78.31%、78.10%，見表 1。

表1 羥基紅花黃色素A的血漿蛋白結(jié)合率

3 討論

3.1 血漿蛋白結(jié)合的研究，包括結(jié)合機(jī)制、潛在的結(jié)合相互作用、血漿蛋白結(jié)合對膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響等研究內(nèi)容，其中血漿蛋白結(jié)合率的測定為主要的基礎(chǔ)研究。常用的方法有平衡透析法(equilibrium dialysis)、超濾法(ultra-filtration)、超速離心法(ultracentrifugation)、凝膠過濾法(gel filtration)等，本實(shí)驗(yàn)采用的方法是超濾離心法，實(shí)驗(yàn)操作簡便，不耗時，同時采用固-液萃取法處理血漿樣品，回收率高。

游離藥物濃度存在于不含血漿蛋白的血清之中，有文獻(xiàn)報告可用10 000 r/min分離血清去掉血漿蛋白，但通過試驗(yàn)效果不好，其并不能完全分離血漿，測定結(jié)果偏低，而采用超濾離心的方法效果令人滿意，數(shù)據(jù)及結(jié)論可靠［7］。

3.2 本實(shí)驗(yàn)所選用的劑量是根據(jù)藥物的臨床成人每天用藥推薦劑量按體表面積等效換算成家兔用藥劑量，以其保證人用劑量在實(shí)驗(yàn)研究范圍內(nèi)，因而設(shè)定低、中、高三個劑量分別為5、10、20 mg/kg。其中中、高劑量高于臨床人用劑量。

此外，取血時間設(shè)定為家兔耳緣靜脈注射藥物后15 min時，因?yàn)轭A(yù)實(shí)驗(yàn)表明此時藥物在體內(nèi)的分布可以完全達(dá)到平衡，此時測定的血漿蛋白結(jié)合率應(yīng)該是比較準(zhǔn)確的，可以視為初始狀態(tài)，因此采樣的時間定為15 min。

3.3 羥基紅花黃色素A的血漿蛋白結(jié)合率較高，預(yù)示有一定的長效作用，并有一個相對較大的生物半衰期，藥動學(xué)研究證實(shí)了這一點(diǎn)。因此，在臨床給藥方案設(shè)計時應(yīng)注意給藥的間隔時間。雖然動物的長期毒性試驗(yàn)表明連續(xù)用藥并未發(fā)現(xiàn)藥物的蓄積與毒性，但是在臨床聯(lián)合用藥時，還是應(yīng)該注意對羥基紅花黃色素A血漿蛋白結(jié)合有競爭性抑制作用的藥物的配伍使用。

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