蘇 梅， 楊和金， 崔 濤， 楊宏博， 趙春梅， 楊生元

(云南省藥物研究所，云南昆明 650111)

燈 盞 細 辛Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.Mazz，又名燈盞花，為菊科植物短亭飛蓬的干燥全草，是云南省民族民間常用中草藥，具有活血通絡(luò)止痛，祛風(fēng)散寒的功效。臨床上用于治療缺血性心腦血管疾病，特別是對中風(fēng)性偏癱、胸痹心痛等癥有非常良好的作用［1］。本研究中的燈盞花提取物是應(yīng)用現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)手段從馴化栽培的燈盞細辛全株植物中提取分離得到的混合物，它主要含有燈盞花乙素、飛蓬苷、總咖啡酸酯和少量燈盞花甲素等成分。研究證明燈盞花乙素為燈盞細辛的主要活性成分之一［2-3］;李國輝等用近紅外光譜鑒別證明栽培燈盞花和野生燈盞花的主要化學(xué)成分燈盞花乙素含量有明顯的差別，其范圍是:種植燈盞花素0.2% ～0.5%，野生燈盞花素0.085% ～0.15%。栽培燈盞花中燈盞花乙素含量明顯高于野生的燈盞花，生藥質(zhì)量優(yōu)于野生燈盞花［4］。根據(jù)原野生植物的藥理作用、臨床功效和該提取物的藥效初篩結(jié)果，我們對其治療缺血性心腦疾病的有效性進行研究，為燈盞細辛的人工栽培和深入研究提供可靠的藥效學(xué)研究依據(jù)。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器 TM1024全自動生化分析儀，日本東京株式會社;UV-2501紫外分光光度計，日本島津公司生產(chǎn);Centrifuge 5810R型冷凍離心機，德國eppendoff公司;BS110型電子分析天平，賽多利斯公司;6951D型心電機，北京普利生集團;MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)，北京航空航天大學(xué)圖象中心。

1.2 受試藥品 栽培燈盞花提取物為黃色粉末(以下簡稱燈盞花提取物)，原材料來自云南省石林縣鹿阜鎮(zhèn)種植地，提取物批號:20071104，由云南省藥物研究所植化室提供。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，20 mg/kg為初始起效劑量，因此正式試驗時設(shè)60、40和20 mg/kg 3個劑量組，臨用前用0.2%CMC-Na配制成所需濃度供動物灌胃給藥用。

1.3 對照藥品 燈盞花素片(由天然燈盞花提取物制備，臨床劑量換算大鼠的用量為12.33 mg/kg)，云南省藥物所制藥廠生產(chǎn)，批號20080616。試驗時大鼠用量為60 mg/kg，臨用前用0.2%CMC-Na配制成所需的濃度，供動物灌胃給藥用。

1.4 試劑 紅四氮唑(TTC)，Sigma公司出品，批號:20030609;肌酸激酶(CK)試劑盒，批號:20090806，南京建成生物制品研究所;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒，批號:20090806，南京建成生物制品研究所;MDA試劑盒，批號:20090904，南京建成生物工程研究所;SOD試劑盒，批號:20090904，南京建成生物工程研究所;蛋白定量試劑盒，批號:20090904，南京建成生物工程研究所。

1.5 實驗動物及飼養(yǎng)條件 SD雄性大鼠，體質(zhì)量200～250 g;由昆明醫(yī)學(xué)院動物中心提供，許可證號:SCXK(滇)20050008;飼料許可證:SCXK(滇)20050009;動物使用許可證:SCXK(滇)20050001。飼養(yǎng)于本所天然藥物篩選研究中心動物實驗室，溫度:20～26℃(日溫差≤4℃);濕度:40% ～70%;換氣次數(shù):10～20次/h;氣流速度:0.1～0.2 m/s;噪音:≤60 dB;工作照度:150～300 lx;動物照度:15～20 lx;照明:12 h:12 h明暗交替。

2 實驗方法

2.1 燈盞花提取物對局灶性腦缺血損傷模型的影響［5-8］

2.1.1 大腦中動脈阻斷(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型的制備和給藥方案 110只雄性大鼠，隨機分為假手術(shù)組(Sham Operation，SHO)、模型組(Model)、燈盞花素片組(Breviscapinun Tablet，BCT)、燈盞花提取物(Extract of CulturalErigeron Breuiscapus，ECEB)(60、40、20 mg/kg)3 個劑量組，假手術(shù)組10只動物，各造模組20只?？瞻捉M和模型組給等容量的0.2%CMC-Na溶液，其余各組均按劑量給藥，連續(xù)給藥8 d，于末次給藥后30 min，腹腔注射35%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，沿頸正中線切開皮膚，暴露右側(cè)頸總動脈，分離頸內(nèi)、外動脈，從頸外動脈游離端插入3#尼龍線(直徑0.285 mm)，從頸外動脈遠心端將尼龍線導(dǎo)入到頸內(nèi)動脈，插至Willis環(huán)大腦中動脈處，以有效阻斷大腦中動脈，插入的尼龍線長度距頸總動脈分叉處18～20 mm。然后將頸外動脈游離端連同腔內(nèi)尼龍線一并結(jié)扎，以防出血。逐層縫合皮下筋膜和皮膚，局部滴加抗菌素防止感染。右側(cè)上肢未見明顯偏癱的大鼠從試驗中剔除。各組挑選神經(jīng)功能評分值在8～11分的動物10只。

2.1.2 觀察指標

2.1.2.1 神經(jīng)功能損害程度評定 分別于造模后3、6、12、24 h根據(jù)下述表1評分標準，采用盲法對動物進行行為障礙評分，用于評價神經(jīng)功能的損害程度，總分為16分，分數(shù)越高，表明動物神經(jīng)功能損害程度越嚴重。

2.1.2.2 對24 h大腦梗死范圍的影響 造模24 h后，斷頭取腦，迅速冰凍，沿冠狀面切成2 mm厚的切片，腦片放入1%TTC染液中，避光37℃溫孵30 min進行染色，10%甲醛溶液固定一周后，采用數(shù)碼相機成像系統(tǒng)將數(shù)字影象存儲于計算機中，并用北京航空航天大學(xué)圖象中心的MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)測量梗死區(qū)和全腦面積，計算腦梗死范圍(梗死區(qū)面積占全腦面積百分比)。

2.1.2.3 對24 h大腦水含量的影響 將染色后的腦組織置于60℃烘箱中，烤至恒重，稱定其干質(zhì)量，計算腦含水量。腦組織含水量(%)=(1－腦組織干質(zhì)量/腦組織濕重)×100%。

2.1.2.4 對大腦海馬中 MDA、SOD、GSH-Px 的影響 取腦后迅速取出海馬，置于冰箱 (－20℃)保存?zhèn)溆谩?0 d內(nèi)，加入適量2～3℃生理鹽水研磨制成10%的腦組織勻漿，離心取上清液按試劑盒方法測定MDA量和SOD、GSH-Px活力。

表1 MCAO大鼠神經(jīng)功能損害程度評分標準Tab.1 Scoring standard of neurofunctional injury in MCAO rats

2.2 燈盞花提取物對心肌缺血的影響［9-12］

2.2.1 模型制備和給藥方案 110只SD大鼠，雌雄各半，隨機分為假手術(shù)組(Sham Operation，SHO)、模型組(Model)、燈盞花素片組(Breviscapinun Tablet，BCT)、燈盞花提取物(Extract of CulturalErigeron Breuiscapus，ECEB)(60、40、20 mg/kg)3 個劑量組，假手術(shù)組10只動物，各造模組20只?？瞻捉M和模型組給等容量的0.2%CMC-Na溶液，其余各組均按劑量給藥，連續(xù)給藥8 d，于末次給藥后30 min，腹腔注射35%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，仰臥位固定，行開胸手術(shù)暴露心臟，于左心耳與肺動脈圓錐處下方穿線結(jié)扎冠狀動脈左支，假手術(shù)組僅置線頭不結(jié)扎，心臟快速復(fù)位并關(guān)閉胸腔。收緊結(jié)扎線造成缺血，以收緊結(jié)扎線后動物的心電圖標準導(dǎo)聯(lián)ST抬高為模型成功，各組挑選模型成功動物10只。

2.2.2 觀察指標

2.2.2.1 對心肌缺血大鼠Ⅱ?qū)碾妶DST段的影響

記錄結(jié)扎前及結(jié)扎后 5、30、120、240 min肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，測量ST段的變化值。

2.2.2.2 對心肌缺血大鼠心肌酶學(xué)的影響 動物造模24 h測定心電圖后，頸動脈插管取血，分離血清按試劑盒方法測定LDH和CK的活性。

2.2.2.3 對大鼠心肌梗死范圍的影響 取血后處死動物迅速摘出心臟，置于冰生理鹽水中泵出心腔內(nèi)積血，去掉心房及脂肪組織，吸干水分稱取心室重，隨后沿冠狀切成5片，在2%TTC溶液中避光于37℃ 孵育染色10 min。經(jīng)染色后，正常心肌組織呈紅色，而梗死組織呈白色，將梗塞部位剪下稱重，以梗死部分占心室重的百分比為心肌梗死范圍的指標。2.3 統(tǒng)計方法 采用統(tǒng)計軟件SPSS17.0進行單因素方差分析，實驗結(jié)果以±s表示。

3 試驗結(jié)果

3.1 燈盞花提取物對腦缺血的影響

3.1.1 燈盞花提取物對MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的影響 大鼠MCAO造模后，活動減少，與假手術(shù)組比較動物出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能障礙(P＜0.001)。灌服燈盞花提取物的大鼠神經(jīng)功能障礙均有不同程度改善，與模型組動物比較具有顯著性差異，6 h時60 mg/kg劑量改善了 27.05%(P＜0.01)，12 h 時60、40 mg/kg劑量分別改善了39.32%(P＜0.01)、23.60(P＜0.05)，24 h 時 60、40 mg/kg劑量分別改善了43.26%(P＜ 0.01)、31.73%(P＜ 0.05)，20 mg/kg劑量在24 h神經(jīng)功能障礙評分具有顯著意義，改善率為24.03%(P＜0.05)。與相同劑量的燈盞花素片比較，該提取物對MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的改善作用(P＜0.01)強于燈盞花素片(P＜0.05)，且其起效時間更早。見圖1。

圖1 燈盞花提取物對MCAO大鼠神經(jīng)功能障礙的影響(± s，n=10)Fig.1 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on the neurological deficit of MCAO rats(± s，n=10)

3.1.2 燈盞花提取物對MCAO大鼠腦梗死范圍的影響 從表2可看出模型組動物的腦梗死范圍明顯增加，該燈盞花提取物60、40 mg/kg劑量能顯著縮小MCAO大鼠的大腦梗死范圍，且作用成劑量依賴關(guān)系，腦梗死范圍分別縮小了42.59%、35.86%。與相同劑量的燈盞花素片比較，該提取物抗腦梗死的作用(P＜0.01)優(yōu)于燈盞花素片(P＜0.05)。

表2 燈盞花提取物對MCAO大鼠腦梗死范圍的影響(± s，n=10)Tab.2 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on cerebral infarction size of MCAO rats(± s，n=10)

表2 燈盞花提取物對MCAO大鼠腦梗死范圍的影響(± s，n=10)Tab.2 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on cerebral infarction size of MCAO rats(± s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01?！鳳 ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001，vs SHO group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量/(mg/kg) 腦梗死范圍/% 縮小率/%SHO CMC-Na 20 mL/kg 0.0 ±0.0—ModelCMC-Na 20 mL/kg 21.08 ±7.15▲▲▲ —BCT 60 14.80 ±5.56* 29.79 ECEB 60 12.10 ±5.02＊＊ 42.59 40 13.52 ±6.32* 35.86 20 16.56 ±4.57 21.14

3.1.3 燈盞花提取物對MCAO大鼠大腦含水量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組動物大腦含水量明顯增加，出現(xiàn)顯著的腦水腫現(xiàn)象。灌服燈盞花提取物60、40 mg/kg劑量的大鼠大腦含水量顯著降低，降低率為75.46%、37.5%。結(jié)果顯示該燈盞花提取物對MCAO大鼠的大腦含水量有顯著的抑制作用，其抑制作用(75.46%)顯著大于相同劑量的燈盞花素片(40.28%)。見表3。

表3 燈盞花提取物對MCAO大鼠大腦含水量的影響(± s，n=10)Tab.3 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on the water content in the brain tissues of MCAO rats(± s，n=10)

表3 燈盞花提取物對MCAO大鼠大腦含水量的影響(± s，n=10)Tab.3 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on the water content in the brain tissues of MCAO rats(± s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同劑量的燈盞花素片(BCT)比較:▼ P ＜0.05?！鳳 ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001，vs SHO group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，vs model group;▼ P ＜0.05，vs BCT group.

組別 劑量/(mg/kg) 腦含水量/% 腦水腫抑制率/%SHO CMC-Na 20 mL/kg 77.36 ±0.44—ModelCMC-Na 20 mL/kg 79.52 ±0.99▲▲▲ —BCT 60 78.65 ±0.51* 40.28 ECEB 60 77.89 ±0.89＊＊＊▼ 75.46 40 78.71 ±0.55* 37.5 20 78.98 ±0.83 25.0

3.1.4 燈盞花提取物對MCAO大鼠大腦脂質(zhì)過氧化的影響 模型組動物大腦海馬中的SOD(P＜0.01)、GSH-PX(P＜0.001)水平較正常組明顯降低，MDA(P＜0.05)水平顯著升高;表明大鼠腦缺血損傷后引起明顯腦脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，灌服燈盞花提取物的大鼠大腦海馬中MDA的含量顯著降低，SOD、GSH-PX的活力顯著增加。結(jié)果提示該燈盞花提取物具有明顯的抗氧化作用，其抗氧化作用強于相同劑量的燈盞花素片。見圖2。

圖2 燈盞花提取物對MCAO大鼠大腦MDA、SOD、GSH-Px的影響(± s，n=10)Fig.2 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on MDA，SOD and GSH-Px in the brain of MCAO rats(± s，n=10)

3.2 抗心肌缺血的作用

3.2.1 對心肌缺血大鼠心電圖J點的影響 大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎后，各組動物與術(shù)前組和假手術(shù)比較Ⅱ?qū)碾妶DST段都顯著抬高，模型組尤為顯著。術(shù)后5、30、120、240 min各時間點上，與模型組比較灌服燈盞花提取物的大鼠ST段抬高程度均顯著低于模型組。見圖3。

3.2.2 對大鼠心肌梗塞范圍的影響 冠狀動脈結(jié)扎24 h后，大鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的缺血梗死區(qū)，灌服燈盞花提取物60、40 mg/kg劑量的大鼠心肌梗死范圍顯著縮小，與模型組動物比較縮小率分別為38.6%、20.7%，提示該提取物對大鼠急性心肌梗死有顯著的拮抗作用，其作用(▲▲P＜0.001)優(yōu)于同劑量的燈盞花素片(▲▲P＜0.01)。見表4。

3.2.3 對心肌缺血大鼠心肌酶LDH和CK活性的影響 從圖4可看出大鼠冠狀動脈結(jié)扎24 h后，血清中的LDH和CK含量顯著增高，與假手術(shù)組比較具有顯著性差異(▲▲P＜0.01)。灌服燈盞花提取物的大鼠血清中的LDH和CK的含量均顯著降低，其作用與同劑量的燈盞花素片相當。見圖4。

圖3 燈盞花提取物對急性心肌缺血大鼠心電圖ST段抬高的影響(± s，n=10)Fig.3 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on ST-segment elevation of electrocardiogram in myocardial ischemia of rats(± s，n=10)

表4 燈盞花提取物對大鼠心肌梗塞范圍的影響(± s，n=10)Tab.4 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on myocardial infarction size in rats(± s，n=10)

表4 燈盞花提取物對大鼠心肌梗塞范圍的影響(± s，n=10)Tab.4 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on myocardial infarction size in rats(± s，n=10)

注:與假手術(shù)組比較，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001;與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01，▲▲▲P ＜0.001，vs SHO group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，vs model group.

組別 劑量(mg/kg) 心肌梗塞范圍/% 縮小率/%SHO CMC-Na 20 mL/kg 0—Model CMC-Na 20 mL/kg 33.28 ±5.60▲▲ —BCT 60 25.79 ±2.84＊＊ 22.51 ECEB 60 20.43 ±4.62＊＊＊ 38.6 40 26.38 ±3.58＊＊ 20.7 20 29.27 ±5.13 12.1

4 討論

圖4 燈盞花提取物對心肌缺血大鼠LDH和CK-MB活性的影響(± s，n=10)Fig.4 The effect of extract from Erigeron Breusicapus on the activity of LDH and CK-MB in myocardial ischemia of rats(± s，n=10)

燈盞細辛是十分重要的野生天然藥物，為目前治療缺血性心腦血管疾病最為有效的天然藥物，有效率達95%以上，且其毒副作用較低、臨床治療安全、適用，被列為國家中藥保護品種［13］。近年來由于心腦血管疾病的高發(fā)，人們對這種高效低毒藥物的需求快速增長，而由于過度的采挖，野生資源在不斷的減少，有的地區(qū)資源已處于枯竭狀態(tài)。為緩解供求矛盾，90年代中期人們開始引種馴化栽培燈盞花，云南作為燈盞花的主產(chǎn)地，已建立了多個燈盞花的規(guī)?；N植基地，目前有的還建成了GAP基地。本研究中的燈盞花提取物就是應(yīng)用現(xiàn)代化學(xué)技術(shù)手段從馴化栽培的燈盞細辛全株植物中提取分離得到的混合物。根據(jù)原野生植物的藥理作用、臨床功效和該提取物的藥效初篩結(jié)果，我們選擇了與人類缺血性心腦疾病相似的動物模型:大鼠MCAO致局灶性腦缺血、大鼠冠狀動脈結(jié)扎致心肌缺血模型對其治療心腦血管疾病的有效性進行研究，來驗證該提取物的抗腦缺血和心肌缺血的作用。試驗結(jié)果顯示:該提取物能顯著改善MCAO大鼠的神經(jīng)功能障礙、縮小腦梗死范圍和抑制腦水腫，明顯降低MCAO大鼠大腦中的MDA，增加SOD、GSH-PX的的活力。對冠狀動脈結(jié)扎大鼠心電圖ST段的抬高程度有顯著的降低作用，還可顯著縮小冠狀動脈結(jié)扎大鼠的心肌梗死范圍和降低血清中CK-MB和LDH的活性。以上結(jié)果證明該提取物對實驗性大鼠腦缺血和急性心肌梗死損傷具有顯著的保護作用，其保護作用優(yōu)于同等劑量的燈盞花素片。

以上實驗結(jié)果證明栽培燈盞花提取物具有明確的抗腦缺血、抗心肌缺血的作用。在確保療效的基礎(chǔ)上，人工栽培燈盞花不僅解決了燈盞花野生資源的不足和滿足了廣大患者對燈盞花素的需求，最關(guān)鍵的是它降低了人類對生態(tài)環(huán)境的破損強度。因此燈盞花的馴化栽培成功不僅具有醫(yī)學(xué)意義，更具有十分重要的社會環(huán)境意義，在今后的深入研究和臨床應(yīng)用中它比野生天然燈盞花更具有可持續(xù)發(fā)展的優(yōu)勢。

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