宋麗軍， 趙文昌

（廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞 523808）

HPLC雙指標(biāo)研究大孔樹脂純化甘草酸的優(yōu)化工藝及圖譜分析

宋麗軍， 趙文昌*

（廣東醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，廣東東莞 523808）

目的 在大孔樹脂純化甘草酸工藝研究基礎(chǔ)上，探討進一步純化甘草酸的優(yōu)化方法。方法 采用高效液相色譜法檢測甘草酸、甘草苷，優(yōu)化AB-8大孔吸附樹脂純化甘草酸最佳上樣量，采用HPLC圖譜分析提取物成分變化。結(jié)果

HPLC圖譜顯示優(yōu)化后提取物未見甘草苷，峰A～D等未知成分部位的峰明顯減小；甘草酸純度由26.3%達到35.8%。結(jié)論 所建立的甘草酸、甘草苷雙指標(biāo)優(yōu)化甘草酸的大孔樹脂富集純化工藝的方法簡便、合理，可有效去除甘草提取物中甘草苷及某些雜質(zhì)成分的干擾。

甘草酸；甘草苷；大孔樹脂；高效液相色譜法；工藝優(yōu)化

甘草Glycyrrhiza Radix et Rhizoma是一味應(yīng)用極廣的中藥材，素有“十方九草”之稱。國內(nèi)外學(xué)者對甘草的化學(xué)成分和藥理作用進行了許多研究，認為主要有效成分是甘草酸和黃酮類化合物［1］。甘草酸具有抗炎、抗病毒等多種藥理作用，為得到純度較高的甘草酸提取物，一般常用煎煮法［2］，超聲提取法［3］，稀氨水回流提?。?］等方法提取，采用大孔樹脂法［5-6］、酸沉反復(fù)結(jié)晶、雙水相萃取等工藝純化，其中大孔樹脂法一般可從大孔樹脂的種類和用量、藥液的吸附流速、洗脫用乙醇的濃度和流速、洗脫液收集點、洗脫乙醇用量等方面優(yōu)選純化工藝。但是我們按上述參數(shù)優(yōu)選大孔樹脂富集純化甘草酸的工藝后發(fā)現(xiàn)，甘草酸有效部位中仍含有非目標(biāo)成分甘草苷，從而影響有效部位的純度。中藥成分復(fù)雜，理化性質(zhì)各異，針對大孔樹脂吸附解脫前后的多指標(biāo)成分變化控制工藝參數(shù)選擇的研究較少。為此我們進行深入研究，首次建立HPLC法測定甘草酸、甘草苷雙重指標(biāo)考察優(yōu)選甘草酸純化工藝的方法，僅通過對上樣量的優(yōu)化，達到有效去除甘草苷及未知成分部位干擾的目的。目前大孔樹脂純化工藝中關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)-上樣量的選擇主要是檢測目標(biāo)成分單一指標(biāo)確定上樣量［7］，本實驗建立的雙重指標(biāo)檢測可對其它中藥采用大孔樹脂純化工藝研究關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)的方法選擇提供參考和依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 Agilent 1200 Series高效液相色譜系統(tǒng)（四元梯度泵、自動進樣器、G1315A紫外-DAD檢測器、ChemSation色譜工作站）；超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。AUW 220D十萬分之一電子分析天平（日本島津公司）。甘草酸銨（批號：110731-200511）、甘草苷對照品（批號：111521-200202），中國藥品生物制品檢定所。甘草藥材購于廣東大參林連鎖藥店有限公司東莞市大嶺山分店，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2010年版規(guī)定。AB-8大孔吸附樹脂（天津市光復(fù)精細化工研究所）。乙腈（Sigma公司，色譜級）；Milli-Q Biocel超純水系統(tǒng) （廣州東銳科技有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 樹脂的預(yù)處理 樹脂以2BV 5%NaOH 80℃浸泡6 h，淋凈堿后以蒸餾水洗至流出液呈中性，再以2BV 95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹，用乙醇洗至紫外吸收小于0.03，再以蒸餾水洗至無醇，待用。

2.2 HPLC測定樣品中甘草酸、甘草苷 方法參見文獻［8］，測定甘草酸的色譜條件為色譜柱Kromasil 100-5 C18（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相 甲醇-0.06 mL/L醋酸銨（冰醋酸調(diào)pH為4）66∶34；體積流量：0.7 mL/min；波長250 nm；柱溫室溫。測定甘草苷的色譜條件為色譜柱同上；流動相 乙腈-0.5%冰醋酸（1∶4），體積流量：0.7 mL/min；波長276 nm；柱溫室溫。

2.3 甘草氨水初提物的制備 稱取甘草飲片適量，HPLC分別測定甘草飲片中甘草酸、甘草苷，8倍生藥量0.3%稀氨水回流提取2次，1 h/次，合并提取液，濃縮樣品液至4倍生藥量，加稀鹽酸調(diào)pH值至2，靜置30 min，離心20 min（3 000 r/min），沉淀60℃烘干，即得甘草氨水初提物。按2.2項下測定甘草酸粗粉中甘草酸、甘草苷。

2.4 甘草酸的純化

2.4.1 以甘草酸為指標(biāo)確定上樣量，制備甘草提取物T1根據(jù)對AB-8大孔吸附樹脂純化甘草酸的上柱液濃度、pH、吸附速率、吸附時間等工藝指標(biāo)的優(yōu)化考察，將甘草酸粗粉稀釋10倍，調(diào) pH6.5，吸附速率為 1 mL/min，分別以0.5 ～8BVmL上經(jīng)過預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱（2 cm×15 cm）吸附30 min，再用蒸餾水洗柱，收集殘液，準確記錄殘液體積，HPLC測定殘液中甘草酸的濃度。結(jié)果見圖1。

從圖1中可以看出當(dāng)上樣量為4BV時，甘草酸泄漏開始顯著增加，因此初步確定上樣量為4BV，并制備甘草提取物T1。

2.4.2 甘草酸－甘草苷為指標(biāo)確定最佳上樣量 根據(jù)2.4.1 項的結(jié)果，取 0.5、1、1.5、2、3、4 BV 甘草酸粗粉 10 倍稀釋液，調(diào)pH 6.5，吸附速率為1 mL/min，上經(jīng)過預(yù)處理的AB-8大孔樹脂柱（2 cm×15 cm）吸附30 min，根據(jù)對洗脫及濃度、洗脫速率、洗脫劑用量等工藝指標(biāo)的優(yōu)化考察結(jié)果，用4BV蒸餾水洗柱至洗脫液無色，再分別以7BV 50%乙醇溶液洗脫各樹脂柱，體積流量2 mL/min，收集洗脫液，濃縮，HPLC測定甘草苷，結(jié)果見圖2。

圖1 以甘草酸為指標(biāo)對上樣量考察

圖2 以甘草苷為指標(biāo)對上樣量二次考察

從圖2中可以看出當(dāng)上樣量為1BV mL時，甘草苷在洗脫液中開始顯著增加，因此綜合對甘草酸、甘草苷兩個指標(biāo)的考察，確定最佳上樣量為1BV，并制備甘草提取物T2。

2.5 甘草藥材、甘草氨水初提物、甘草酸提取物T1、T2的HPLC圖譜比較 本實驗采用中國藥典［8］HPLC方法測定甘草酸，不同樣品測得甘草酸的HPLC圖譜相似，而采用中國藥典［8］HPLC方法測定甘草苷，圖譜中變化明顯。故以樣品的甘草苷圖譜進行比較，見圖3～圖7。

圖3 甘草苷對照品HPLC圖譜

圖4 甘草藥材HPLC圖譜

圖5 甘草氨水初提物HPLC圖譜

圖6 甘草酸提取物T1 HPLC圖譜

圖7 甘草酸提取物T2 HPLC圖譜

圖4顯示甘草藥材除具有明顯的甘草苷的色譜峰（峰1）外，還有未知成分峰A～E。經(jīng)過氨水初提，峰B～D部位峰高明顯降低；經(jīng)過大孔樹脂純化工藝1，T1的圖譜中只有峰A、E及甘草苷比較明顯；采用大孔樹脂純化工藝2，T2的圖譜中只有峰E比較明顯，甘草酸提取物基本已檢測不到甘草苷，未知成分部位的峰A～D等亦不明顯。

2.6 HPLC測定甘草飲片、甘草酸粗粉、甘草酸提取物（T1、T2）甘草酸、甘草苷比較 HPLC分別測定甘草酸提取物T1、T2中甘草酸、甘草苷，結(jié)果見表1。

表1 HPLC測定不同樣品中甘草酸、甘草苷（x ± s，n=3）

計算結(jié)果顯示，通過工藝優(yōu)化處理，綜合選擇最佳上樣量，甘草酸提取物甘草酸純度由26.3%達到35.8%。

3 討論

3.1 大孔樹脂法為目前進行中藥有效成分、有效部位富集純化常用方法，常以目標(biāo)成分作為單指標(biāo)篩選工藝中上樣量、洗脫劑等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)的選擇依據(jù)，并形成一定研究模式。但值得注意的是中藥成分復(fù)雜，只考慮單成分的吸附、洗脫，其它成分過柱的行為不清楚，會成為影響所得產(chǎn)品純度的潛在因素。這一點在已有的大孔樹脂工藝篩選模式中很少為人們所注意到。本研究表明單純只考慮甘草酸單一成分，確定上樣量等純化條件后，洗脫液中確實仍含甘草苷及未知雜質(zhì)成分，從而影響純化效果。

3.2 本實驗采用HPLC測定富集目標(biāo)成分－甘草酸、去除非目標(biāo)成分－甘草苷，優(yōu)化甘草酸大孔樹脂純化工藝的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)－上樣量，HPLC圖譜、測定結(jié)果顯示，該方法簡便、合理，可有效去除非目標(biāo)成分，提高甘草酸提取物的純度。

3.3 比較甘草酸提取物T1圖譜和甘草酸提取物T2圖譜，采用最佳上樣量不僅去除甘草苷，也減少了圖譜中其它未知雜質(zhì)成分的流出。所以，甘草酸提取物T2的甘草酸純度有所提高。

3.3 采用HPLC測定藥材、提取物T1及T2甘草苷的量，樣品色譜圖中峰E（出峰時間約8 min）始終存在，值得進一步深入研究。

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R284.2

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1001-1528（2011）07-1252-03

2010-06-07

宋麗軍（1969—），女，副主任藥師，博士，主要從事中藥新藥研究與質(zhì)量標(biāo)準制定。Tel：（0769）22896547，E-mail：songlijun6981@126.com

*通信作者：趙文昌（1967—），男，博士，主要從事緩控釋制劑研究。Tel：（0769）22896561，E-mail：zhaowenchang@126.com