朱顯靈，潘文杰，陳 懿，陳 偉，李章海，張紀(jì)利，徐增漢，李洪勛

(1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)煙草與健康研究中心，合肥 230051；2.貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽 550023)

煙草腺毛分泌物被認(rèn)為對煙草品質(zhì)和香吃味有良好的貢獻(xiàn)，不同煙草類型和品種葉表面腺毛密度、分泌物性質(zhì)和數(shù)量存在著明顯的差異[1-3]。20世紀(jì) 50年代以來，國內(nèi)外科研人員對煙草腺毛形態(tài)、密度及其分泌物進(jìn)行了大量的研究。采用各種方法提取煙草鮮葉和干葉表面提取物，運(yùn)用氣相色譜（GC）和質(zhì)譜（MS）分析，鑒定出煙草腺毛中主要含有類西柏烷和類賴百當(dāng)二萜、糖脂、表面蠟和一些微量組分[4-14]。眾多研究表明，影響煙草腺毛特征及其分泌物特點(diǎn)的主要因素是遺傳構(gòu)成。Burk 等[15]指出具有非腺型或簡單腺毛的煙草并不產(chǎn)生大量的二萜烯、蔗糖酯、脂肪醇和蠟脂。Severson等[16]指出，不同類型的煙草腺毛分泌物存在明顯差異?？緹熀桶桌邿熤饕笑?西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇、脂肪醇及烴類化合物，而香料煙不僅含有以上成分，還含有順-冷杉醇、賴百當(dāng)萜醇和蔗糖脂等。Nielsen和Severson[17]分析了不同品種及其后代品系腺毛密度和分泌物含量的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)一些腺毛密度很小的品系，其腺毛分泌物的含量與腺毛密度呈正相關(guān)；而腺毛密度大的品系，其腺毛分泌物的含量與腺毛密度不具有密切相關(guān)性。某些品系的西柏三烯二醇含量可達(dá)親本的2～3倍。這說明，煙草腺毛分泌物的化學(xué)成分及其含量不僅受內(nèi)在遺傳組成的影響，而且受其生長環(huán)境眾多外在因素的影響。

煙草生長所處的水肥條件對腺毛分泌物有著重要影響。Severson等[18]指出，適度的水分脅迫能提高煙葉表面西柏三烯二醇和蔗糖酯等腺毛分泌物的含量，強(qiáng)降雨會顯著降低煙葉表面化合物的含量。時向東等[19]研究表明，餅肥等有機(jī)肥能增加腺毛密度，但其作用因葉位和腺毛種類的不同而有差異。Gamou and Kawashima[20]和 Court等[21]研究表明，增施氮肥有時會減少煙葉表面西柏三烯二醇的含量，但有時對煙葉表面化學(xué)成分沒有顯著影響。

為探明貴州煙葉腺毛分泌物成分和含量的差異，分析它們與貴州煙葉品質(zhì)和風(fēng)格特點(diǎn)的關(guān)系，筆者選取4個貴州當(dāng)前主栽品種和新育成品種，分下、中、上3個部位逐次采收成熟鮮葉，對其葉表面物質(zhì)進(jìn)行了分析測定。

1 材料與方法

1.1 取樣

在貴州省煙草科學(xué)研究所龍崗試驗(yàn)站（貴陽市開陽縣）選擇云煙 85、K326、貴煙 201和南江 3號4個品種，選取15株生長均勻一致的煙株掛牌，分上、中、下3個部位（第3～4葉代表下部葉、9～10葉代表中部葉、16～17葉代表上部葉）各采摘成熟煙葉30片，其中15片供提取葉表面物質(zhì)使用，另15片供測定煙葉含水量。

1.2 提取

將煙樣稱重，然后在裝有1000 mL二氯甲烷的3個燒杯中浸洗。在第1只燒杯中浸洗4次，每浸1次在溶劑中停留2 s。待二氯甲烷揮發(fā)后，再在第2、3只燒杯中重復(fù)浸洗，每次浸洗時葉片倒順提取（即上次最后提取的葉片首先被浸洗）。3次提取完成后，將含有葉面提取物的溶劑過濾到平底燒瓶內(nèi)（濾紙內(nèi)放無水硫酸鈉 50 g），過濾漏斗、燒杯和濾紙均用二氯甲烷沖3次以上。然后將浸提液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在 40 ℃下濃縮，最后移入琥珀色瓶中，定容至10 mL，置0 ℃左右的暗處備測。

1.3 葉表面提取物分析

用芳樟醇作內(nèi)標(biāo)，提取定容的煙葉腺毛分泌物濃縮物2 mL，加入1 mL內(nèi)標(biāo)，再濃縮至1 mL，用GC和GC/MS進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 葉表面提取物總量

不同品種之間葉表面提取物含量存在明顯差異（表1）。南江3號葉表面提取物平均總量最低，每克鮮葉為75.76 μg；K326次低，每克鮮葉為194.49μg；貴煙 201較高，每克鮮葉為 237.53 μg；云煙85最高，每克鮮葉為283.01 μg。云煙85葉表面提取物總量是南江3號的3倍以上。

不同品種各部位的葉表面提取物含量亦差異明顯。南江 3號下部煙葉表面提取物中煙堿含量9.91 μg/g，云煙 85 為 34.73 μg/g，相差 3.5 倍；K326中部葉酮類含量 2.31 μg/g，云煙 85為 16.34 μg/g，相差 7倍以上；K326的中部葉萜烯類含量 29.86μg/g，云煙85為237.25 μg/g，相差近8倍；南江3號上部葉烷烴類含量23.85 μg/g，貴煙201為163.77μg/g，相差亦近7倍。

表1 不同品種葉表面提取物主要成分含量Table1 Contents of major cuticular components from green leaf of different tobacco varieties μg/(g mf)

2.2 葉表面提取物萜烯類物質(zhì)含量

萜烯類物質(zhì)是煙草葉表面提取物的主要成分。檢測表明，煙草腺毛分泌物的萜烯類物質(zhì)主要有新植二烯、松香油、西柏烷、西柏三烯一醇、α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇。由于新植二烯含量極低（所有品種各個部位每克鮮葉含量均在0.5 μg以下)，故在此不作分析。

松香油在葉表面提取物中含量較豐富（表2）。南江3號葉表面提取物中松香油平均含量最低，為15.12 μg/g，K326（23.19 μg/g）次低，貴煙 201（36.88μg/g）較高，云煙85含量最高，所有部位平均含量達(dá)53.30 μg/g。品種間葉表面提取物松香油含量不僅有差異，而且部位間變化不一致。K326和貴煙201煙葉表面提取物中松香油含量隨著部位的升高而增加，而南江3號和云煙85煙葉表面提取物中松香油含量以中部葉最高，上部其次，下部最低。西柏烷類是煙葉表面提取物中最重要的萜烯類物質(zhì)，包括西柏烷和各種西柏三烯醇。從圖1可以看出，不同品種葉表面提取物中西柏烷類物質(zhì)含量差異很大。南江 3號含量很低，K326含量較低（尤其是中下部葉），貴煙 201含量較高（特別是上部煙葉），云煙85含量最多（不過其下部葉含量不高）。各品種葉表面提取物西柏烷類物質(zhì)含量之比為m(南江 3 號):m(K326):m(貴煙 201):m(云煙 85)＝1:1.94:3.39:5.86。

表2 不同品種烤煙葉表面提取物中松香油含量Table2 Contents of retinol of major cuticular components from green leaves of different tobacco varieties μg/(g mf)

各品種葉表面提取物中的西柏烷類含量，總體隨著煙葉部位的升高而增加，但增加的數(shù)量和幅度差異很大，導(dǎo)致品種間不同部位的西柏烷類物質(zhì)含量比例發(fā)生變化。下部葉之比為 m(南江 3號):m(K326):m(貴 煙 201):m(云 煙 85)＝1:1.04:1.33:5.74，中部葉為m(南江3號): m(K326):m(貴煙 201):m(云煙 85)＝1:0.59:1.38:5.85，上部葉為 m(南江3號):m(K326):m(貴煙 201):m(云煙 85)＝1:4.21:6.82:5.88。K326和貴煙201的中、下部煙葉表面提取物西柏烷類含量與南江3號差異不大，上部葉差異明顯，而云煙85與南江3號的含量始終差異很大，前者大約是后者的6倍。

圖1 不同品種葉表面提取物西柏烷類含量Fig.1 The contents of cembrenoid of major cuticular components from green leaves of different tobacco varieties

2.3 葉表面提取物西柏三烯醇含量

西柏三烯醇是煙葉表面提取物中萜烯類物質(zhì)的最主要成分，主要包括西柏三烯一醇和西柏三烯二醇（α和β兩種異構(gòu)體），不同品種葉表面提取物中西柏三烯醇含量差異很大（表3）。從低到高排序?yàn)槟辖?號＜K326＜貴煙201＜云煙85。K326和貴煙201葉表面提取物中的西柏三烯醇含量，隨葉位的升高而增加，南江3號和云煙85煙葉表面提取物中西柏三烯醇含量以中部葉最高，上部其次，下部最低。說明品種間葉表面提取物中西柏三烯醇含量不僅有數(shù)量差異，而且部位間變化也不一致。

各品種西柏三烯二醇的含量多于西柏三烯一醇，但不同品種各種西柏三烯醇的實(shí)際含量存在較大差異。

就西柏三烯一醇而言，不同品種各部位葉表面提取物中的含量順序?yàn)椋耗辖?3號＜K326＜貴煙201＜云煙85。除南江3號外，K326、貴煙201和云煙85的含量都是隨著葉位的升高而增加。

各品種葉表面提取物中的西柏三烯一醇含量，大致隨葉位的升高而增加（南江 3號除外），但各品種增加的幅度并不一致，且具體數(shù)量有差別。從總含量上看，南江3號＜K326＜貴煙201＜云煙85。南江 3號葉表面提取物中的西柏三烯一醇含量很低，以中部葉含量最高，但也僅為4.59 μg/g；K326的葉表面提取物中西柏三烯一醇含量也比較低，尤其是其中下部位葉，其上部葉含量稍高，達(dá) 13.13μg/g；貴煙201各個部位煙葉表面提取物中西柏三烯一醇含量差異最大，其上部含量達(dá)27.32 μg/g，是其下部葉含量的 26倍以上，為所有品種的最大值；云煙 85下部葉表面提取物中西柏三烯一醇的含量相對較高，其中上部葉中的含量幾乎相等，總含量為所有品種最高。

表3 不同品種葉表面提取物各種西柏三烯醇含量Table3 Contents of cembratriene-ol of major cuticular components from green leaves of different tobacco varieties μg/(g mf)

各品種的葉表面提取物中 α-西柏三烯醇二醇的含量差異很大：南江3號含量很低，中部葉大于上部葉（3倍以上）；K326和貴煙201的含量也較低，都隨葉位的升高而增加；云煙 85含量最高，尤其是中部葉，達(dá)到49.38 μg/g，分別是上部葉和下部葉（7.55 μg/g 和 4.43 μg/g）的 6.5 倍和 11 倍（表3）。

與α-西柏三烯醇二醇相比，各品種葉表面提取物中β-西柏三烯醇二醇的含量較高，不同品種和部位間差別很大。從總量上看，南江3號含量很低，中、上部葉片含量相近；K326含量較低，其上部葉含量遠(yuǎn)高于中部葉（5.7倍）；貴煙201含量較高，尤其是上部葉，含量達(dá)到37.06 μg/g，為所有品種的最大值；云煙 85的含量最高，中、上部葉片含量幾乎相等（表3）。

2.4 葉表面提取物烷烴類含量

鮮葉表面提取物的烷烴類成分主要是高級烷烴，包括二十九烷、異三十烷、三十烷、異三十一烷、三十一烷、異三十二烷、三十二烷、異三十三烷、三十三烷。

從圖4可以看出，不同品種葉表面提取物中烷烴類成分差別較大。從總量上看，貴煙201最多，K326次之，云煙85較少，南江3號最少。下、中、上三部位煙葉表面提取物烷烴類含量，貴煙201分別為71.16, 107.41, 163.77 μg/g，K326為70.07, 68.56,155.56 μg/g，云煙 85 為 54.48, 108.87, 76.47 μg/g；南江3號為25.0, 33.38, 23.85 μg/g。各品種烤煙的烷烴類總量比為 m(貴煙 201):m(K326):m(云煙85):m(南江 3 號)＝1:0.86: 0.7:0.24。

表4 不同品種烤煙葉表面提取物主要烷烴含量Table4 Contents of hydrocarbons of major cuticular components from green leaves of different tobacco varieties μg/(g mf)

從烷烴類成分上看，三十二烷和三十三烷（包括兩種異構(gòu)體）的含量較高，特別是三十二烷。各品種之間不僅含量存在很大差異，而且部位變化亦不相同。貴煙201的葉表面提取物中三十二烷最多，且隨著部位的升高而增加；K326含量較多，其上部葉含量明顯高于中下部葉；云煙 85含量中等，各部位煙葉含量相近；南江3號含量很少，中部煙葉含量很低。

3 討 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，烤煙鮮葉表面提取物主要包括煙堿、酮類、萜烯類和烷烴類。由于煙堿是在煙株根部合成后運(yùn)輸?shù)竭_(dá)煙葉表面的，而不是在腺毛內(nèi)合成分泌到葉表，一般不將之作為主要腺毛分泌物來考慮，因此烤煙鮮葉表面提取物主要成分是腺毛分泌物（包括降解產(chǎn)物酮類）和烷烴類，這與Chang等[10]和Severson等[22]的結(jié)果相似。

不同品種鮮葉表面提取物總含量和各種物質(zhì)含量差異明顯。4個品種葉表面提取物平均總量排序?yàn)椋辖?號＜K326＜貴煙201＜云煙85，云煙85葉表面提取物總量是南江3號的3倍以上。不同品種各種葉表面提取物的含量差異更大，最高含量品種（云煙85）所含酮類、萜烯類和烷烴類等主要葉表面提取物是最低含量品種（南江3號）的7～8倍。本研究試驗(yàn)材料來自同一試驗(yàn)地點(diǎn)，生態(tài)條件和土壤類型相同，施肥量和栽培措施相近，因此可以推論品種間煙葉表面提取物和腺毛分泌物差異主要是由品種自身的遺傳組成所決定的。這與楊鐵釗等人的研究結(jié)論基本一致[23]。

國外研究結(jié)果認(rèn)為，有些腺毛分泌物的合成受單基因控制[24-25]，有些腺毛分泌物的合成受多基因控制[15,26-27]，因此，煙草腺毛分泌物的種類及含量取決于其遺傳組成[28-29]。基于這些研究結(jié)果，研究人員曾試圖從腺毛密度和分泌物含量入手，培育腺毛分泌物含量高的煙草品種[30]。

萜烯類物質(zhì)是煙草葉表面提取物的主要成分，主要包括新植二烯、松香油、西柏烷、西柏三烯一醇、α-西柏三烯二醇和β-西柏三烯二醇等。新植二烯含量最少，西柏烷類含量最多。煙葉表面提取物中西柏烷類包括西柏烷和各種西柏三烯醇。不同品種葉表面提取物中西柏烷類物質(zhì)含量差異很大，所測定4個品種的西柏烷類物質(zhì)總量之比為，m(南江3 號):m(K326):m(貴煙 201):m(云煙 85)＝1:1.94:3.39:5.86。

作為最主要的西柏烷類物質(zhì)，西柏三烯醇在各品種葉表提取中不僅含量高，而且變化大。所測定4個烤煙品種的西柏三烯醇總量排序?yàn)?，南?號＜K326＜貴煙201＜云煙85。K326和貴煙201西柏三烯醇含量隨著葉位的升高而增加，南江3號和云煙 85中部葉含量最高。各個品種西柏三烯二醇的含量多于西柏三烯一醇，β-西柏三烯醇二醇的含量稍高于α-西柏三烯醇二醇。這與前人的研究結(jié)果并不完全一致[31]。這可能是由于品種、煙葉成熟度（幼葉和成熟葉）、栽培措施及分析方法等眾多因素影響的緣故。這也說明，煙葉表面提取物的種類和數(shù)量不僅受制于種質(zhì)的遺傳組成，而且與生態(tài)條件、栽培措施和分析測定環(huán)節(jié)有十分密切的聯(lián)系。

[1]Wagner G.Leaf surface chemistry [M]//David D L,Nielsen M T.Tobacco production, chemistry and technology.Oxford: Blackwell Science, 1999: 292-303.

[2]冀浩，李雪君，趙永振，等.浸提葉面分泌物對烤煙品質(zhì)的影響[J].中國煙草科學(xué)，2008，29（2）：13-17.

[3]史宏志，劉國順.煙草香味學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：83.

[4]Onishi I, Yamasaki K.Sudies on the essential oils of tobacco leaves.I.Acid fraction[J].Agr Chem Soc Japan B, 1955(19): 137-142.

[5]Onishi I, Nagasawa M.Studies on the essential oils of tobacco leaves.II.Carbonyl fraction[J].Agr Chem Soc Japan B, 1955(2): 143-147.

[6]Onishi I, Nagasawa M.Studies on the essential oils of tobacco leaves.VII.Carbonyl fraction (2) [J].Agr Chem Soc Japan B, 1957(21): 38-42.

[7]Onishi I, Tomita T, Fukuzumi T.Studies on the essential oils of tobacco leaves.XV.Neutral fraction (2) [J].Agr Chem Soc Japan B, 1957(21): 239-242.

[8]Roberts D L, Rowland R L.Macrocyclic Diterpenes.α and β-4,8,13-Duvatriene-1,3-diols from Tobacco[J].J Org Chem, 1962(27): 3989-3992.

[9]Chakraborty M K, Weybrew J A.The chemistry of tobacco trichomes[J].Tob Sci, 1963(7): 122-127.

[10]Chang S Y, Grunwald C.Duvatrienediol, alkanes, and fatty acids in cuticular wax of tobacco leaf of various physiological maturity[J].Phytochemistry, 1976(15):961-963.

[11]Johnson A W, Severson R F, Hudson J, et al.Tobacco leaf trichomes and their exudates [J].Tob Sci, 1985(29):67-72.

[12]Chang K W, Weeks W W, Weybrew J A.Changes in the surface chemistry of tobacco leaf during curing with particular emphasis on trichomes[J].Tobacco Science,1985(29): 122-127.

[13]Weeks W W, Sisson V A, Chaplin J F.Differences in aroma, chemistry, solubility, and smoking quality of cured flue-cured tobaccos with aglandular and glandular Trichomes[J].J Agric Food Chem, 1992, 40(10):1911-1916.

[14]韓錦鋒，王廣山，遠(yuǎn)彤，等.烤煙葉面分泌物的初步研究[J].中國煙草，1995，16（2）：10-13.

[15]Burk L G.Inheritance of the glandless leaf trichome trait in Nicotiana tabacum[J].Tob Sci, 1982(26): 51-53.

[16]Severson R F, Johnson A W, Jackson D M.Cuticular constituents of tobacco[J].Recent Adv Tob Sci 1985(11):105-174.

[17]Nielsen M T, Severson R F.Variation of flavor components on leaf surfaces of tobacco genotypes differing in trichome density [J].J Agric Food Chem,1990, 38(2): 467-471.

[18]Severson R F, Arrendale R F, Chortyk O T, et al.Isolation and characterization of the sucrose esters of the cuticular waxes of green tobacco leaf [J].J Agric Food Chem,1985, 33(5): 870-875.

[19]時向東，劉國順，韓錦峰，等, 不同類型肥料對烤煙葉片腺毛密度、種類及分布規(guī)律的影響[J].中國煙草學(xué)報(bào)，1999，20（2）：19-22.

[20]Gamou K，Kawashima N.Studies on leaf surface lipid of tobacco: Compositional change in alkane during growth and senescence of leaf [J].J Agri Biol Chem, 1979,43(10): 2163-2168.

[21]Court W A, Elliot J M, Hendel J G.Influence of applied nitrogen fertilization on certain lipids, terpenes, and other characteristics of flue-cured tobacco [J].Tob Sci,1984(28): 69-72.

[22]Severson R F, Jackson D M, Chaplin J F.The effect of plant age and curing on cuticular leaf chemical levels and composition[C]// 36th TCRC, 1982.

[23]楊鐵釗，李偉，李欽奎，等.烤煙葉面腺毛密度及其分泌物變化動態(tài)的相關(guān)分析[J].中國煙草科學(xué)，2005，26（1）：43-46.

[24]Nielsen M T, Jones G A, Collins G B.Inheritance pattern for secreting and nonsecreting glandular trichomes in tobacco[J].Crop Sci, 1982(22): 1051-1053.

[25]Coussirat J C, Schiltz P, Reid W W, et al.Diterpenes in Nicotiana tabacum I.Genetic control of the production of (z)-abienol and α and β-cembratriene diols [J].Ann du Tabac, 1983-1984(2): 123-130.

[26]Gwynn G R, Severson R F, Jackson D M, et al.Inheritance of sucrose esters containing β-methylvaleric acid in tobacco[J].Tob Sci, 1985(29): 79-81.

[27]Johnson J C, Nielsen M T, Collins G B.Inheritance of glandular trichomes in tobacco [J].Crop Sci, 1988(28):241-244.

[28]Reid W W.The phytochemistry of the genus Nicotiana[J].Ann du Tabac, 1974(11): 145-183.

[29]College A, Reid W W, Russell R.The diterpenoids of Nicotiana species and their potential technological significance[J].Chem Ind, 1975(5): 570-571.

[30]Nielsen M T, Severson R F.Inheritance of a diterpene constituent in tobacco trichome exudate [J].Crop Sci,1992(32): 1148-1150.

[31]Severson R F, Arrendale R F, Chortyk O T, et al.Quantitation of the major cuticular components from green leaf of different tobacco type [J].J Agric Food Chem, 1984, 32(3): 566-570.