李 仙，董 偉，段繼銘，彭國崗，王定偉

[1.云南瑞升煙草技術(shù)（集團(tuán)）有限公司，昆明 650106；2.紅塔煙草（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100]

羊肚菌( Morchella conica) 隸屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)、盤菌綱（Discomycetes）、盤菌目(Pezizales)、羊肚菌科(Morchellaceae)[1]。作為珍稀的大型真菌，羊肚菌含有大量的真菌多糖及菌物氨基酸，具有獨(dú)特的風(fēng)味，是世界上最著名的食藥兩用菌之一[2]。但是由于資源局限問題，很難在煙用香精香料中大規(guī)模使用。本研究從生物技術(shù)角度，分離出羊肚菌的菌絲體，利用菌絲體的延展性和羊肚菌代謝纖維素、木質(zhì)素的生物學(xué)特性，首次將其在煙葉水提后的碎片上培養(yǎng)成功，將煙葉中的纖維素、木質(zhì)素等不可提取的骨架基質(zhì)轉(zhuǎn)化為多糖等成分。并以發(fā)酵固嵺為香料提取的原料，采用真菌多糖的乙醇沉淀分離工藝獲得具有含量較高真菌多糖的提取物[3]。并對羊肚菌發(fā)酵多糖進(jìn)行了致香成分分析、熱烈解分析及在卷煙中的應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種以云南野生黑脈羊肚菌子實(shí)體及菌柄等部位為原料采用大型真菌菌絲分離的試管法[4]，經(jīng)3次傳代后獲得羊肚菌菌絲體，斜面形態(tài)見圖 1。煙葉、煙碎片及煙末由車間提供。

儀器為高壓蒸汽滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）、SKY-211B恒溫?fù)u床（上海素坤儀器有限公司）及生化試劑（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）。

圖1 野生羊肚菌斜面菌絲形態(tài)Fig.1 The mycelium of wild Morchella esculenta（L.）Pers.

1.2 方法

1.2.1 羊肚菌發(fā)酵原料的選擇 羊肚菌是低溫高濕嗜好的大型真菌，具有代謝木質(zhì)素、纖維素的能力，選用富含纖維素、木質(zhì)素的煙葉、煙葉碎片、煙末及其水提處理煙渣為原料進(jìn)行試用固體培養(yǎng)基的配制（水:固料=3:2），121 ℃，滅菌30 min后接種羊肚菌菌絲進(jìn)行發(fā)酵原料的篩選。

1.2.2 發(fā)酵用種子的培養(yǎng) 羊肚菌固體發(fā)酵用種子培養(yǎng)采用兩種方式：液體搖瓶培養(yǎng)和固體菌棒培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基采用文獻(xiàn)[5]提供的培養(yǎng)基配方1（蔗糖2%、酵母膏0.5%、KH2PO40.05%、MgSO40.05%，pH 5.5）；實(shí)驗(yàn)室篩選的最適液體培養(yǎng)基配方2[玉米汁2%、酵母膏2% 、MgSO40.05%、KH2PO40.1%、(NH4)2SO40.5%，pH 7]及固體培養(yǎng)基（采用煙葉碎片水提渣，配制方法同 1.2.1），3種培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)5 d后接種煙葉碎片水提渣，7 d后進(jìn)行發(fā)酵程度的對比。

1.2.3 羊肚菌發(fā)酵多糖樣品的制備 以適合菌絲生長的煙葉碎片水提渣進(jìn)行羊肚菌固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。條件：接種量5%、溫度22 ℃，濕度60%～70%，時(shí)間9 d。發(fā)酵后固嵺加入2倍水，采用多糖較適溶出溫度90～95 ℃，回流提取2 h，提取2次，合并水提液。濃縮后采用4倍95%乙醇沉淀多糖類物質(zhì)，離心得多糖成分，65 ℃干燥2 h，呈淺黃色固體粉末即為羊肚菌發(fā)酵多糖，溶解后呈棕紅色。

1.2.4 羊肚菌發(fā)酵多糖中糖類的分析 羊肚菌發(fā)酵多糖中單糖及雙糖測定采用高效液相色譜分析，分析條件：HPLC：waters 2690，檢測器：waters 2410示差檢測器，色譜柱：waters carbohydrate cartridge（4.6×250 mm cartridge）。檢測結(jié)果表明，羊肚菌發(fā)酵多糖中不含葡萄糖、果糖、麥芽糖及蔗糖，其含糖類型為真菌多糖。

羊肚菌發(fā)酵多糖的測定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[6]。準(zhǔn)確稱取羊肚菌發(fā)酵多糖0.095 g定容100 mL后稀釋20倍，同標(biāo)準(zhǔn)曲線測定OD490 nm。

1.2.5 羊肚菌發(fā)酵多糖揮發(fā)性成分分析 取羊肚菌發(fā)酵多糖10.0 g同時(shí)蒸餾萃取后進(jìn)行GC/MS分析，總離子流圖見圖2，分析結(jié)果采用面積歸一法?；衔锒ㄐ苑治鍪歉鶕?jù)GC-MS 聯(lián)用所得質(zhì)譜信息經(jīng)計(jì)算機(jī)用Wiley、NISt 98 譜庫與標(biāo)準(zhǔn)譜圖對照、解析，確認(rèn)其中的化學(xué)成分。

圖2 羊肚菌發(fā)酵多糖致香成分總離子流圖Fig.2 Total ion current of the polysaccharide extract

1.2.6 羊肚菌發(fā)酵多糖熱裂解分析 稱取4 mg羊肚菌煙草發(fā)酵多糖放入熱裂解儀中，分別在 300、600、900 ℃時(shí)進(jìn)行熱裂解，裂解產(chǎn)物進(jìn)入GC/MS進(jìn)行分離和鑒定，應(yīng)用Wiley、NISt 98 譜庫進(jìn)行檢索。

1.2.7 羊肚菌發(fā)酵多糖的煙用效果評價(jià) 將羊肚菌發(fā)酵多糖添加至 1#、2#云南某品牌卷煙加料絲中，添加量0.002%，置于22 ℃和RH60%恒溫恒濕箱平衡水分24 h后卷制成卷煙進(jìn)行評吸。

2 結(jié) 果

2.1 羊肚菌發(fā)酵煙葉原料的選擇

以煙葉、煙碎片、煙末及相應(yīng)水提后煙渣為主要篩選對象，經(jīng)過羊肚菌固體渥堆發(fā)酵后結(jié)果如表1。結(jié)果表明，由于煙葉本身具有部分煙堿抑制了羊肚菌菌絲的生長，未提取的3種形式的煙葉原料均不適合羊肚菌發(fā)酵，而水提后的原料以煙葉碎片為最佳，發(fā)酵原料碎片間有合適的間隙，具有較好的通氣性，利于菌絲蔓延。

2.2 種子發(fā)酵方法的選擇

采用兩種液體發(fā)酵培養(yǎng)基和一種固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行接種對比后結(jié)果如表 2，結(jié)果表明，固體菌棒培養(yǎng)的種子具有接種點(diǎn)多，生長速度較快的優(yōu)點(diǎn)，可以作為固體發(fā)酵接種的種子來源。

表1 羊肚菌發(fā)酵原料篩選結(jié)果Table1 Screening results of tobacco matrix suitable for the growth of Morchella esculenta（L.）Pers.

表2 羊肚菌發(fā)酵用種子篩選結(jié)果Table2 Screening results of vaccination methods

2.3 真菌多糖含量的測定

通過苯酚-硫酸法測定以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=0.0127x-0.0073（R2=0.9939），如圖 3。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Glucose standard curve

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度為 5.52～23.92 μg/mL范圍內(nèi)吸光值與多糖含量呈良好的線性關(guān)系。按要求將樣品稀釋至測定范圍，結(jié)果表明，發(fā)酵煙草多糖0.095 g定容100 mL后稀釋20倍，同上標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，吸光度為 OD490 nm=0.281，計(jì)算真菌多糖含糖量為42.6%。

2.4 羊肚菌發(fā)酵多糖揮發(fā)性成分分析

羊肚菌發(fā)酵多糖主要成分是真菌多糖類物質(zhì)，略有羊肚菌的天然菌香，GC/MS技術(shù)分析后共鑒定出匹配度在80以上的化合物13個(gè)，檢測結(jié)果顯示主要為長鏈碳酸及其酯類。檢測總離子流圖見圖2，結(jié)果見表3。

2.5 羊肚菌發(fā)酵多糖熱裂解分析

羊肚菌發(fā)酵多糖熱裂解分析結(jié)果見表4。結(jié)果表明，羊肚菌發(fā)酵多糖在300 ℃熱裂解產(chǎn)物較少，均為酮類及醛類物質(zhì)，在600 ℃及900 ℃熱裂解產(chǎn)物較多，主要產(chǎn)物除糠醛類物質(zhì)外，還有多種呋喃類和醛酮類成分，這與羊肚菌發(fā)酵多糖中高含量的真菌多糖類物質(zhì)相吻合，裂解主要成分具有甜香、煙草香等香味特征，理論上具有改善卷煙的吸味、豐滿煙香等功能。

表3 羊肚菌發(fā)酵多糖主要香氣成分分析Table3 The compositional analysis results of the polysaccharide extract

2.6 羊肚菌發(fā)酵多糖在卷煙中的應(yīng)用效果評價(jià)

羊肚菌發(fā)酵多糖添加至1#、2#云南某品牌卷煙加料絲中，評價(jià)結(jié)果見表 5。結(jié)果表明，羊肚菌發(fā)酵多糖在醇和煙香，提高舒適性，去除雜氣等方面具有明顯效果。

3 結(jié) 論

3.1 羊肚菌在煙葉基質(zhì)上的生長特性

野生羊肚菌分離得到的菌絲對煙草中的煙堿呈現(xiàn)不耐受的特點(diǎn)，通過本研究表明，羊肚菌對煙葉基質(zhì)要求分散度較好，具有合適的溶氧空隙。通過水提后的煙葉碎片在羊肚菌的適宜生長條件下（溫度22℃，濕度60%～70%），能夠獲得較大的生長量，且蔓延度好，菌絲保持較高的白度，可以作為羊肚菌固體渥堆發(fā)酵的基質(zhì)使用。

3.2 羊肚菌發(fā)酵多糖成分的研究

羊肚菌多糖（MEP）有別于煙草多糖成分如纖維素、半纖維素、果膠等成分，相反羊肚菌可以以該類分為底物生成由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖等殘基為重復(fù)單元組成的雜多糖[7]，根據(jù)真菌多糖不溶于乙醇的特點(diǎn)，對真菌多糖進(jìn)行粗提，其中真菌多糖含量達(dá)到42.6%，香氣分析表明，致香成分含量較少，僅檢測出 13種，大部分為長鏈碳酸及其酯類，但通過熱裂解表明，羊肚菌發(fā)酵多糖可在抽吸時(shí)形成糠醛類物質(zhì)外，還有多種呋喃類和醛酮類香氣成分，對豐富煙香、改善吸味具有較好效果。

表4 羊肚菌發(fā)酵多糖熱裂解成分分析Table4 The pyrolysis results of the polysaccharide extract

表5 羊肚菌發(fā)酵多糖在卷煙中的試用效果Table5 The evaluation of cased cigarettes and flue-cured tobacco of the polysaccharide extract

3.3 羊肚菌發(fā)酵多糖的應(yīng)用效果

羊肚菌發(fā)酵多糖在卷煙中的試用結(jié)果表明，其在醇和煙香、提高舒適性、去除雜氣等方面具有較好的作用，且用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通香精香料的用量，可適用于卷煙加料及煙葉醇化。

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