胡重怡，蔡劉體

（貴州省煙草科學(xué)研究所，貴陽(yáng) 550018）

貴州是種煙歷史悠久的主產(chǎn)煙區(qū)，在長(zhǎng)期的種植過程中，選育出了不少優(yōu)良地方品種（系），作為一筆寶貴的煙草種質(zhì)資源，弄清這些地方品種（系）之間的親緣關(guān)系，對(duì)分析貴州煙草品種布局、地方品種資源歸類及今后育種親本的選擇都有一定的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，分子生物學(xué)迅猛發(fā)展，不斷涌現(xiàn)出適用于種群遺傳分析的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。其中Zietkiewicz等[1]人于1994年發(fā)展的一種基于微衛(wèi)星系列的分子標(biāo)記技術(shù)簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間ISSR（inter simple sequence repeat），其基本原理是根據(jù)植物廣泛存在SSR(simple sequence repeat)本身設(shè)計(jì)引物，同時(shí)在SSR的5’或者3’端添加2～4個(gè)非重復(fù)隨機(jī)選擇的錨定堿基，以引起特定序列位點(diǎn)的擴(kuò)增，提高了PCR擴(kuò)增反應(yīng)的專一性[2]。由于SSR在真核生物中的分布非常普遍，并且進(jìn)化變異速度非常快，因此 ISSR引物可以檢測(cè)基因組位點(diǎn)的更多差異[3]。ISSR具有簡(jiǎn)便、無(wú)需預(yù)先知道序列信息、重復(fù)性強(qiáng)、通用性好等特點(diǎn)，在植物的物種鑒定[4-5]、系統(tǒng)進(jìn)化[6-7]及遺傳圖譜構(gòu)建[8]等方面得到廣泛應(yīng)用，其在水稻、小麥、玉米、油菜、青麻、煙草等作物上已成功應(yīng)用[9-14]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記手段來(lái)分析品種（系）間的親緣關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中的供試品種（系）見表1。

表1 供試煙草品種（系）名稱及來(lái)源Table1 Origins of tobacco materials used in the study

1.2 煙草葉片DNA提取

各材料用DNeasy? Plant Mini Kit（QIAGEN）試劑盒，按照操作說(shuō)明提取煙草DNA。

1.3 ISSR擴(kuò)增

參照哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條通用引物，引物由上海生工合成。從中篩選出23條擴(kuò)增條帶較多，重復(fù)性好的引物對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)在eppendorf公司的Mastercycler gradient PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL PCR反應(yīng)總體積，20μL中，1×Taq 酶配套緩沖液，0.5U Taq 聚合酶，0.5 μmol/L引物，0.125 mmol /L dNTPs，1.5 mmol/L MgCl2，1 ng/μL模板DNA。擴(kuò)增條件經(jīng)優(yōu)化后確定為：95℃ 5 min；94℃ 30 sec，52 ℃ 30 sec，72 ℃ 40 sec，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

PCR產(chǎn)物在8%的聚丙烯胺凝膠垂直電泳中進(jìn)行電泳分離，在25℃，120V恒壓下電泳2.0 h，用銀染法顯影[15]。

1.4 ISSR分析

ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1、9統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，相同遷移位置的有帶記為1，無(wú)帶記為0，擴(kuò)增失敗或者缺失的記為9。遺傳相似系數(shù)按公式GS＝2Nij/(Ni＋Nj）計(jì)算，其中Nij表示基因型間共有帶數(shù)目，Ni和Nj表示兩基因型各自的條帶數(shù)目，遺傳距離GD＝1－GS計(jì)算，使用用SimQual統(tǒng)計(jì)17份煙草資源之間的遺傳相似系數(shù)，按照UPGMA的方法畫出聚類樹狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 煙草DNA的提取與檢測(cè)

DNA瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，本文電泳排列順序均從左至右依次為：DL2000 Marker、遵煙6號(hào)、TD3、金煙1號(hào)、草海1號(hào)、婁山1號(hào)、畢納1號(hào)、興煙1號(hào)、QN-1、ZYMT-1、CZ-1、TZ-1、黔西1號(hào)、NC82、紅花大金元、K326、云煙85、貴煙11，從圖1可以看出實(shí)驗(yàn)樣品DNA提取完好，無(wú)RNA、蛋白污染，無(wú)拖尾現(xiàn)象，可以用作DNA分子標(biāo)記篩選等分析實(shí)驗(yàn)。

2.2 地方性煙草品種（系）的ISSR多態(tài)性

23條ISSR引物，均能擴(kuò)增出來(lái)7～22條帶，其中有9條引物在17個(gè)地方品種中擴(kuò)增出多態(tài)，圖2、圖3分別為引物UBC810、UBC836擴(kuò)增出的圖譜。9條引物共擴(kuò)增出了173個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)51個(gè)，多態(tài)比例為29.48%。

由圖2可以看出，利用UBC810引物，每個(gè)品種（系）都有各自的指紋圖譜，可以把不同的品種（系）區(qū)分開。即使是親緣關(guān)系很近的品種，如K326和云煙85之間，也可以根據(jù)各自特異條帶區(qū)分開來(lái)（圖2、圖3）。

利用NTSYS2.0軟件對(duì)多態(tài)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用SimQual計(jì)算遺傳相似系數(shù)（GS）結(jié)果見表2，并用SAHN根據(jù)UPGMA進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖如圖4。從聚類圖（圖4）可以看出，除遵煙6號(hào)、婁山1號(hào)和TD33個(gè)品種（系）外，其余14個(gè)品種（系）大致可以分為3個(gè)組群，紅花大金元組群包含7個(gè)品種（系），NC82組群包括4個(gè)品種（系），K326組群包括3個(gè)品種（系）。表2顯示，貴煙11和草海1號(hào)的遺傳相似系數(shù)最遠(yuǎn)，為0.2127；金煙1號(hào)和QN-1、CZ-1兩者的遺傳相似系數(shù)最近，為0.7872。

3 討 論

圖1 17個(gè)煙草品種（系）DNA電泳圖Fig.1 Electrophoresis pattern of 17 tobacco samples total DNA

圖2 UBC810 引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 ISSR bands of tobacco amplified by UBC810

圖3 UBC836 引物擴(kuò)增結(jié)果 Fig.3 ISSR bands of tobacco amplified by UBC836

表2 17個(gè)煙草品種之間遺傳相似性分析Table2 Genetic similarity of 17 tobacco samples based on ISSR analysis

本研究首次對(duì)貴州地方性品種之間的親緣關(guān)系做出了初步探索，23條ISSR引物對(duì)17個(gè)品種（系）進(jìn)行分析，有9條引物擴(kuò)增出了多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)比例為29.48%。且利用這9條引物，每個(gè)品種（系）都有各自的指紋圖譜，可以把不同的品種（系）區(qū)分開。這說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用來(lái)作為指紋圖譜和品種鑒定手段來(lái)利用，借以彌補(bǔ)煙草分子標(biāo)記手段缺乏的不足。

由聚類圖（圖4）可以看出，貴州地方品種（系）大致可以分為3個(gè)組群，分別為紅花大金元組群、NC82組群和K326組群。貴州在長(zhǎng)期煙草種植過程中，紅花大金元、NC82、K326作為主栽品種一直充當(dāng)著重要的角色，在長(zhǎng)期的馴化過程中，經(jīng)由自然突變、系選、雜交等手段又涌現(xiàn)了許多體現(xiàn)貴州特色的本地品種（系），這些品種（系）大多比較適應(yīng)貴州的特有氣候環(huán)境，為豐富貴州特色品種、創(chuàng)造新種質(zhì)起了一定的作用。

圖4 17個(gè)煙草品種的聚類分析Fig.4 Genetic relationship of 17 tobacco samples generated from ISSR data

由聚類圖（圖 4）可以看出，貴州地方特色品種（系）與常規(guī)品種之間的親緣關(guān)系較近，地方品種（系）在DNA水平上的多態(tài)性，遠(yuǎn)沒有其在表現(xiàn)型上的多態(tài)性豐富。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)煙草育種的常用親本主要集中在Hicks和Coker139系列及其衍生的幾個(gè)品種資源里，導(dǎo)致現(xiàn)在種植品種（系）遺傳背景狹窄。此外，由于煙草是自花授粉作物，本身變異較少，基因型相似性比較高，這可能是烤煙種質(zhì)遺傳多樣性較低的主要原因。由此可見在今后的育種過程中，應(yīng)該多考慮親本之間的遺傳距離，通過選擇遺傳距離遠(yuǎn)的親本雜交來(lái)擴(kuò)寬煙草種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)，豐富煙草基因型種類，引入外源基因。

[1]Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994, 20: 176-183.

[2]肖海峻，孟利前.ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2006（4）：31-33.

[3]張立榮，徐大慶，劉大群.SSR和ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，25（1）：90-94.

[4]Fang D Q, Roose M L.Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers[J].Theoretical and Applied Genetics, 1997, 95:408-417.

[5]Virk P S, Zhu J, Newbury H J.Effectiveness of different classes of molecular marker for classifying and revealing variation in rice (Oryza sativa) germplasm[J].Euphytica,2000, 112: 275-284.

[6]Tsumura Y, Ohba K, Strauss S H.Diversity andinheritance of inter2 simple sequence repeat polymorphisms in Douglas-fir (Pseudotsuga menziesii)and sugi (Cryptom eria japonica)[J].Theoretical and Applied Genetics, 1996, 92: 40-45.

[7]Esselman E J, Li J Q, Crawford D.Clonal diversity in the rare Calamagrostis porteri ssp. insperata(Poaceae):Comparative results for allozymes and random amp lified polymorphic DNA (RAPD) and inter-simple sequence repeat (ISSR) markers[J].Molecular Ecology,1999, 8: 443-451.

[8]Bornet B, Branchard M.Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR) markers: Rep roducible and specific tools for genome fingerprinting[J].Plant Molecular Biology Reporter, 2001, 19: 209-215.

[9]黃光文，陳覺梁，王偉成.運(yùn)用ISSR標(biāo)記鑒別水稻品種的初步研究[J].雜交水稻，2006，21（3）：64-67.

[10]杜金昆，姚穎垠，倪中福.普通小麥、斯卑爾脫小麥、密穗小麥和輪回選擇后代材料 ISSR分子標(biāo)記遺傳差異研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（5）：445-452.

[11]景建洲，李東亮，張勇.利用ISSR標(biāo)記鑒別玉米品種的初步研究[J].玉米科學(xué)，2007，15（6）：16-18.

[12]馬朝芝，傅廷棟.用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析中國(guó)和瑞典甘藍(lán)型油菜的遺傳多樣性[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（11）：1403-1408.

[13]Kurokawa S, Shimizu N, Uozumi S.ISSR variation in a worldwide collection of velvetleaf (Abutilon theophrasti)and the genetic background of weedy strains mingled in grains imported into Japan[J].Weed Biology and Management, 2003, 3: 179-183.

[14]楊本超，肖炳光，陳學(xué)軍.基于ISSR標(biāo)記的烤煙種質(zhì)遺傳多樣性研究[J].煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，1（1）：5-10.

[15]張志峰，史洪才，武堅(jiān).微衛(wèi)星DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）銀染法的改良[J].生物技術(shù)，2005，15（3）：51-53.